[發明專利]一種堿性蛋白酶突變體及其制備

有效

• 申請號: 202011513333.6
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112458072B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;王興吉;李玉;王克芬;劉文龍;張元夫;劉夫鋒;張會圖
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/57;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125;C12R1/07;C12R1/10
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種堿性蛋白酶突變體及其制備。本發明通過提取克勞氏芽孢桿菌基因組DNA，經PCR擴增得到野生型帶有酶原區的堿性蛋白酶基因序列，將擴增得到的野生型堿性蛋白酶基因通過易錯PCR進行隨機突變，通過高通量篩選后獲得了十六個高活力堿性蛋白酶基因。將這十六個突變體基因構建重組載體并在枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌中成功表達，得到產酶活力提高的重組菌株，進一步通過發酵工藝優化獲得新型堿性蛋白酶。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種堿性蛋白酶突變體及其制備。

技術背景：

堿性蛋白酶是指用于水解蛋白質或多肽并且在堿性環境下活力較高、穩定性較好的一類酶，其最適pH一般為9～11，與酸性和中性蛋白酶相比具有作用范圍廣、水解能力強等優點，是目前工業中用量較多的酶之一。堿性蛋白酶在現代工業中具有極其廣泛的用途，是洗滌劑生產、食品工業、醫藥、飼料、化學工業、廢物處理及皮革制造等行業中的重要酶制劑。在洗滌劑中對日常生活中常見的血漬、汗漬、奶漬、油漬等蛋白類污垢具有廣泛的洗滌效果，并且能夠大幅度提高洗滌劑的去污能力；在食品行業可有效應用于動植物蛋白的加工，以改善蛋白食品的品質和風味，增強食品的營養和功能，制備生物活性肽等；在生物技術領域，用于核酸純化過程中蛋白質的去除，如海洋弧菌X4B-7分離的堿性蛋白酶可解聚組蛋白，降解DNA酶；在制革工業中，利用酶法脫毛比傳統灰堿法脫毛的污染更小，且反應條件溫和、水解效率高，可以有效提高制革工業的生產效率和經濟效益。

蛋白酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，由于微生物具有生長速度快，生長條件簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點，使之成為生物酶的重要來源。堿性蛋白酶多來源于微生物，特別是工業微生物產生的堿性蛋白酶其水解能力與耐堿性具有更加明顯的優勢，與動植物來源的堿性蛋白酶相比，微生物堿性蛋白酶可分泌到細胞外，具有下游技術處理相對簡單，價格低廉、來源廣、菌易培養、同時易于實現工業化大批量生產等特點，因此，堿性蛋白酶研究已成為蛋白酶研究的熱點。然而，酶活力不高仍是當前堿性蛋白酶工業化生產的一個最主要的限制因素，因此，開發高活力堿性蛋白酶對其實現工業化生產具有重要意義。

酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略。利用分子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件進化機制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預期特征的結構酶。易錯PCR(Error-prone PCR)是體外定向進化常用方法，是指在擴增目的基因的同時，利用Taq酶不具備3’→5’校對功能，同時改變反應體系中Mn²⁺、Mg²⁺和各種dNTP的濃度，以一定的頻率向目的基因隨機引入堿基錯配，導致目的基因發生隨機突變。然而，經一次突變的基因一般很難獲得滿意的結果，由此又發展出連續易錯PCR(Sequential Error-prone PCR)策略，即將一次PCR擴增得到的產物作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行易錯，使每一次獲得的小突變不斷進行積累而產生重要的有益突變。

芽孢桿菌表達系統具有以下優點：1、能夠高效的分泌各種蛋白質；2、許多芽孢桿菌在發酵工業上的使用已有相當長的歷史，無致病性，不產生任何內毒素；3、芽孢桿菌屬微生物遺傳學背景研究的十分清楚，并且生長迅速，對營養物質無特殊要求等優點；4、密碼子偏愛性不明顯；5、發酵過程簡單，芽孢桿菌屬于好氧菌，無需厭氧發酵設備，發酵結束后，簡單的分離發酵液和細菌菌體可進入目的蛋白的分離、純化回收階段；6、具有抗逆性，可以生產多種耐熱性酶制劑。

因此，本發明中，通過易錯PCR對來源于克勞氏芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因進行分子改造，利用枯草芽孢桿菌表達系統進行高通量篩選，得到酶活力提高的堿性蛋白酶突變體基因，并在解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌體系中成功表達。

發明內容：

本發明目的在于提供一種堿性蛋白酶突變體及其制備。