[發明專利]一種堿性蛋白酶突變體及其基因、工程菌、制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011513325.1
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112501149B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;李玉;張元夫;王興吉;王克芬;劉文龍;劉夫鋒;張會圖
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/57;C12N15/75;C12N15/10;C12N1/21;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/07
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種堿性蛋白酶突變體及其基因、工程菌、制備方法和應用。本發明通過提取克勞氏芽孢桿菌基因組DNA，經PCR擴增得到野生型堿性蛋白酶基因序列，將擴增得到的野生型堿性蛋白酶基因通過易錯PCR進行隨機突變，通過高通量篩選后獲得了若干個高活力堿性蛋白酶基因，再將這些高活力堿性蛋白酶基因進行DNA改組，通過篩選后獲得八個更高活力的堿性蛋白酶突變體基因。將這八個突變體基因構建重組載體并在枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌中成功表達，得到產酶活力提高的重組菌株，進一步通過發酵工藝優化獲得新型堿性蛋白酶。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種堿性蛋白酶突變體及其基因、工程菌、制備方法和應用。

技術背景：

蛋白酶是催化蛋白肽鍵裂解，可將蛋白分子、多肽降解為小的肽鏈、氨基酸的一類水解酶，根據蛋白酶作用時適宜pH值的不同，可分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶，其中堿性蛋白酶的最適反應pH值一般大于9，較其它蛋白酶而言，堿性蛋白酶的酶活力、耐熱、耐堿能力更強，并且具有酯酶特性。這些優勢使得堿性蛋白酶在工業上的應用更為廣泛，其在洗滌劑、食品加工、飼料、環境保護、皮革制造和絲綢制造等行業都有著十分重要的作用。在洗滌劑中加入堿性蛋白酶能保持被洗衣物的原有色彩，提高產品的去污效果，有效減少洗滌劑中表面活性劑和某些助劑的用量，還能增加節水、節能和環境保護的效益。在食品中主要用來水解植物蛋白質，植物蛋白水解后轉化成分子量更小的肽和氨基酸，更利于消化吸收，產品營養價值更高，產品質量和安全性也相對更好。在制革工藝中以蛋白質和蛋白質類似物為主要成分的皮與毛，通常情況下處理較為困難，傳統的方法是利用有毒的化學物質進行處理，這種方法不但危害人們自身安全，而且對環境也有著很大的污染，而蛋白酶可以代替這些化學物質來降解制革過程中非膠質組分和非纖維蛋白，同時也可以減少環境的污染。

微生物是蛋白酶的重要來源，相比于植物蛋白酶和動物蛋白酶，微生物由于其生長迅速、易于人工遺傳改造，產生的蛋白酶類資源豐富微生物可以在相對較短的時間內大量培養，因此可以生產大量的滿足生產需要的酶類。產堿性蛋白酶的微生物主要從鹽堿湖、深海、沙地等堿性環境中分離得到，目前，芽孢桿菌、放線菌以及真菌均有報道可以產堿性蛋白酶，但在工業生產中主要是芽孢桿菌屬。然而，由于菌株自身產酶能力有限，導致了發酵酶活水平不高，芽孢桿菌產堿性蛋白酶的產品成本較高，限制了其大規模的應用。因此，提高堿性蛋白酶活力對其在工業生產及應用具有重要的意義。

蛋白質工程是建立在基因工程基礎上的新技術，主要依靠計算機軟件等輔助設計和蛋白質化學等多學科的基礎知識，通過對蛋白編碼基因的人工定向改造，對蛋白質進行修飾、改造和拼接以獲得能滿足人類需要的新型蛋白質的技術。酶的定向進化又稱為酶的體外分子定向進化，屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程新的發展方向，它不用事先了解蛋白質的結構、活性位點、催化機制等因素，而是模擬自然進化過程，人為地創造特殊的進化條件，從一個或多個已經存在的親本酶(天然的或者人為獲得的酶前體)出發，在體外或體內對基因進行隨機突變或體外基因重組，構建人工突變酶庫，進一步通過一定的篩選或選擇方法，最終獲得預先所期望的具有某些特性的進化酶。體外定向進化常用方法主要是易錯PCR(Error-prone PCR)和DNA改組(DNA shuffling)。易錯PCR是通過利用低保真度TaqDNA聚合酶和改變PCR反應條件，如加入Mn、改變循環次數和dNTP濃度等，降低DNA復制的保真度，在新DNA鏈合成過程中增加堿基錯配，從而使擴增產物出現較多點突變的一種體外誘導DNA序列變異的方法。DNA改組是將一個或一組密切相關的基因序列，在DNaseI作用下切割成一系列隨機大小的DNA小片段，由于基因的同源性，這些小片段之間有部分的堿基序列重疊，它們通過自身引導，隨機重組，最后通過特定引物的PCR，生成全長基因，在這一過程中，由于模板的變換產生了相關序列間的交換，從而產生了多樣的基因重組文庫，再進一步對改組的基因表達的產物進行篩選，從而達到目的基因的定向進化。