[發(fā)明專利]基于CRISPR的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011512116.5
• 申請日: 2020-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN112410343B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊海燕;王瑛;杜悅;段廣才;陳帥印;晉樂飛
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N9/22;C12Q1/6844;C12Q1/14
• 代理公司: 鄭州亦鼎知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41188
• 代理人: 張夏謙

本發(fā)明提供了crRNA 1,其能識(shí)別clfA的SEQ ID NO.1所示靶點(diǎn)，還提供了crRNA2，其能識(shí)別mecA的SEQ ID NO.2所示靶點(diǎn)。本發(fā)明還提供了crRNA1和2組成的組合物，及基于CRISPR的試劑盒及其進(jìn)一步的檢測應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)反復(fù)篩選得出clfA、mecA基因的識(shí)別靶點(diǎn)，進(jìn)而成功實(shí)現(xiàn)靈敏、特異檢測MRSA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于CRISPR的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是一種重要的人類機(jī)會(huì)致病菌，可以引起多種疾病，如：心內(nèi)膜炎，肺炎，中毒性休克綜合征等。青霉素的發(fā)現(xiàn)使感染金葡菌的患者得到了有效治療，但隨著抗生素的大面積使用，很快出現(xiàn)了對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA）。因此構(gòu)建操作簡便的MRSA快速篩查測試非常有必要。CRISPR-Cas（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated (Cas) proteins）系統(tǒng)為基因組編輯提供了革命性的工具，具有替代活性的Cas蛋白成為一種檢測核酸敏感性的強(qiáng)有力的工具。最近的研究顯示利用這些新的CRISPR-Cas技術(shù)為病原體和疾病檢測提供低成本和實(shí)用診斷工具的潛力。Cas12a使用單一的多結(jié)構(gòu)域效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用，由一個(gè)CRISPR RNA(crRNA)和一個(gè)Cas蛋白組裝成一個(gè)核糖核酸復(fù)合物，該crRNA包含針對特定DNA序列的信息。這些多結(jié)構(gòu)域效應(yīng)蛋白通過識(shí)別與目標(biāo)DNA相鄰的PAM序列，使crRNA與目標(biāo)序列互補(bǔ)，進(jìn)而發(fā)生核酸酶剪切作用。

發(fā)明內(nèi)容

一方面，本發(fā)明提供了一種crRNA 1,其能識(shí)別金葡菌特異性識(shí)別基因clfA的SEQID NO.1所示靶點(diǎn)，或者序列如SEQ ID NO.3所示。

一方面，本發(fā)明提供了一種crRNA 2，其能識(shí)別甲氧西林耐藥基因mecA的SEQ IDNO.2所示靶點(diǎn)，或者序列如SEQ ID NO.4所示。

對應(yīng)地，本發(fā)明提供了上述crRNA 1與crRNA 2的組合形式- crRNA組合物，其可用于檢測MRSA金葡菌。

進(jìn)一方面，本發(fā)明提供了一種含上述crRNA組合物的試劑盒，其可含有cas12a蛋白，可稱為基于CRISPR-Cas12a的試劑盒。試劑盒中可含有單鏈DNA熒光探針，結(jié)構(gòu)可為5’6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1。

對應(yīng)地，本發(fā)明提供了使用上述基因或其組合應(yīng)用形式，用于檢測MRSA的方法，該方法可用于非診斷目的，可判定樣品中是否含有甲氧西林耐藥基因或耐藥金葡菌，樣品可為臨床分離的金葡菌標(biāo)本。檢測可包括預(yù)先對樣品進(jìn)行clfA、mecA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增方法可為恒溫?cái)U(kuò)增，如為RAA重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增金葡菌clfA基因用的引物A，其可包含上游引物ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC和下游引物ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC；擴(kuò)增甲氧西林耐藥基因mecA用的引物B，其可包含上游引物CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA和下游引物GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA。

本發(fā)明的有益效果為：經(jīng)反復(fù)篩選得出clfA、mecA基因的識(shí)別靶點(diǎn)，進(jìn)而成功實(shí)現(xiàn)靈敏、特異檢測MRSA。

附圖說明

圖1為clfA基因特異性檢測結(jié)果

圖2為mecA基因特異性檢測結(jié)果

圖3為實(shí)施例2樣品鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面各實(shí)施例均主要涉及如下基因：

1. 金葡菌特異性識(shí)別基因clfA，識(shí)別靶點(diǎn)SEQ ID NO.1:TTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGA