[發明專利]檢測新型冠狀病毒2019-nCoV的引物探針組合

在審

• 申請號: 202011510185.2
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112662810A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 高歌;高利飛;李寧;王瑋;李振紅;付光宇
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及檢測新型冠狀病毒2019?nCoV的引物探針組合。本發明提供的引物探針組合中，包括針對新型冠狀病毒2019?nCoV的ORF1ab基因、N基因引物、探針。該引物和探針具有良好的特異性，結合real time PCR檢測方法，能夠實現對2019?nCoV的快速、準確、靈敏的鑒定。實驗表明，本發明的引物探針的檢測新型冠狀病毒2019?nCoV的ORF1ab基因、N基因最低檢測限均為100copies/ml。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及檢測新型冠狀病毒2019-nCoV的引物探針組合。

背景技術

新型冠狀病毒肺炎是一種急性感染性肺炎，其病原體是一種先前未在人類中發現的新型冠狀病毒，即新型冠狀病毒COVID-19。約半數患者多在一周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。

病毒分離培養是微生物檢測的“金標準”，該法雖然可靠，但耗時、費力不能滿足快速檢測的需要。此外，CT掃描、核酸檢驗(RT-PCR)、免疫識別技術(IgM/IgG的即時檢測(POCT)，酶聯免疫吸附測定(ELISA)等方法也在臨床中被應用于新型冠狀病毒感染的診斷。

在實際應用的過程中發現，常用的免疫學檢測方法雖然具有較高的特異性，但抗體是人體受到新冠病毒刺激后產生的，檢測結果受到抗體產生周期、濃度的影響，因此針對抗體進行的免疫學檢測方法通常結果并不穩定，有時會出現假陽性。目前，熒光定量RT-PCR技術被更多的用來診斷新型冠狀病毒 COVID-19的感染，這種方法具有快速、敏感、特異性強等特點，探針具有高度保守性，大大地提高了檢測效率。

但是目前，針對新型冠狀病毒COVID-19鑒定的基因片段的選擇和引物探針的設計存在不能滿足實際需求的現象，并且，靈敏度高的引物和探針往往存在準確性和特異性不高的問題，而特異性、準確性更高的引物探針，往往靈敏度欠佳。因此，為了實現對新型冠狀病毒COVID-19的準確、靈敏檢測，仍需要進一步開發適用于新型冠狀病毒COVID-19的引物和探針。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供靈敏度和準確性皆高的檢測新型冠狀病毒2019-nCoV的引物探針組合。

新冠病毒2019-nCoV的基因組序列較小，且為單鏈正向RNA，引物和探針涉及可以選擇的保守區域是非常有限的。為了進一步的提高檢測的準確性和靈敏性，必須保證引物和探針具有良好的特異性，且能夠避免在逆轉錄過程中可能產生的干擾。在引物和探針的篩選實驗中發現，引物探針的結構對于檢測結果的影響是非常顯著的，引物探針堿基數量的增減或替換都可能給結果帶來較大的影響。本發明提供的引物探針組合，分別針對新型冠狀病毒 2019-nCoV的ORF1ab基因和N基因進行檢測。其中N基因編碼的核衣殼蛋白是病毒基因組RNA復制復合物的主要組成部分，針對N基因檢測擴增獲得的片段序列如SEQ ID NO:8所示。ORF1a和ORF1b分別兩種復制酶，其序列是最保守的，具有良好的特異性。針對ORF1ab基因檢測擴增獲得的片段如 SEQ ID NO:7所示。

本發明提供的檢測新型冠狀病毒ORF1ab基因的引物探針組合，其中：引物對序列如SEQ ID NO:1～2所示；探針序列如SEQ ID NO:3所示。一些實施例中，如SEQ ID NO:3所示探針的5’端連接FAM熒光基團，3’端連接淬滅基團BHQ1。

本發明提供的檢測新型冠狀病毒N基因的引物探針組合，其中：引物對序列如SEQID NO:4～5所示；探針序列如SEQ ID NO:6所示。一些實施例中，如SEQ ID NO:6所示探針的5’端連接ROX熒光基團，3’端連接淬滅基團 BHQ1。