[發(fā)明專利]一種BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011509062.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112522307A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 師恭曜;田保明;位芳;曹剛強(qiáng);邵偉;翁耀毅;楊戊辰;張澤;張容嘉;郭園園
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/83
• 分類號(hào): C12N15/83;C12N15/66;C12N15/113;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/82
• 代理公司: 西安匯智創(chuàng)想知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 61247
• 代理人: 蘇蓓

1.一種BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體，其中CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，其特征在于，所述重組載體包括BSMV介導(dǎo)的sgRNA重組載體和BSMV介導(dǎo)的split-Cas9重組載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體，其特征在于，所述BSMV介導(dǎo)的sgRNA重組載體包括重組載體BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體，其特征在于，所述BSMV介導(dǎo)的split-Cas9重組載體包括重組載體BSMV-γ2：Cas9N和BSMV-γ2：Cas9C。

4.一種BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

S1，構(gòu)建sgRNA Ti載體；

S11，根據(jù)煙草PDS基因的外顯子序列信息設(shè)計(jì)出NbPDS基因的sgRNA靶標(biāo)序列，然后分析得到兩條合適酶切位點(diǎn)的sgRNA1和sgRNA2；

S12，使用BsaI單酶切pKSE401載體，然后凝膠電泳回收大小約15kb酶切產(chǎn)物；

S13，將sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物退火形成的雙鏈DNA，插入到S12中的酶切產(chǎn)物的線性化載體中，獲得重組載體pKSE401-sgRNA1、pKSE401-sgRNA2；

S2，構(gòu)建BSMV介導(dǎo)的sgRNA重組載體；

S21，使用ApaI單酶切BSMV-γ、BSMV-γ1、BSMV-γ2病毒載體，凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；

S22，使用Q5高保真DNA聚合酶，以sgRNA Ti載體為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出sgRNA1和sgRNA2片段序列，凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

S23，通過(guò)LIC的連接方法，將S21中的線性化載體和S22中的sgRNA片段連接，構(gòu)成重組載體BSMV-γ：sgRNA2、BSMV-γ1：sgRNA1、BSMV-γ2：sgRNA1和BSMV-γ1：sgRNA2、BSMV-γ2：sgRNA2；

S3，構(gòu)建BSMV介導(dǎo)的split-Cas9重組載體；

S31，使用ApaI單酶切BSMV-γ2病毒載體，凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；

S32，將spCas9從其第714(S)個(gè)氨基酸分割，使用Q5高保真DNA聚合酶，以pKSE401載體為模板，分別擴(kuò)增Cas9N端和Cas9C端，獲得split-Cas9片段；

S33，通過(guò)LIC的連接方法，將S31中酶切產(chǎn)物的線性化載體和S32中的split-Cas9片段連接，構(gòu)成重組載體BSMV-γ2：Cas9N、BSMV-γ2：Cas9C。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，S13中sgRNA1和sgRNA2的正向、反向引物為：

sgRNA1正向引物序列：5’-ATTGTTGGTAGTAGCGACTCCATG-3’

sgRNA1反向引物序列：5’-AAACCATGGAGTCGCTACTACCAA-3’

sgRNA2正向引物序列：5’-ATTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGG-3’

sgRNA2反向引物序列：5’-AAACCCTAGGACATCTCTTGCCTC-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的BSMV病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，S32中Cas9N端PCR引物為：

正向引物序列：

5’-AAGGAAGTTTAAATGGATTACAAGGACCACGA-3’

反向引物序列：

5’-CGGGCCAGCCACCGCCACCAGTGCTCACCTGAGCCTT-3’。