[發明專利]一種RNA聚合酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011508966.8
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112608911B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 徐佳琪;蔣宇;陶榮盛;楊立榮;楊晟
• 申請（專利權）人: 湖州中科工業生物技術中心
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/74;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/63;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種RNA聚合酶突變體，其為細菌RNA聚合酶β’亞基rpoC發生第457位酪氨酸突變所形成的突變體，其能夠促進外源重組蛋白在需鈉弧菌中的表達水平，從而增加重組蛋白質生產量，具有商業應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種RNA聚合酶突變體及其在促進外源重組蛋白質表達中的用途。

背景技術

高效的微生物重組蛋白表達系統能夠降低重組蛋白的生產成本。需鈉弧菌(Vibrio natriegens)是一種革蘭氏陰性、對人類非致病的海洋細菌。其倍增周期在7～10分鐘之間，傳代速度比大腸桿菌快一倍，是已知代時最短的自由生活細菌，或可發展為一個特色表達系統。研究發現，需鈉弧菌單個細胞核糖體數量高達115000個，而大腸桿菌只有約70000～90000個，這意味著需鈉弧菌具有更快的生物量合成速度和更強的蛋白表達能力。需鈉弧菌的高生長和高底物攝取速率在作為宿主表達外源蛋白時，有望在前期快速生長，縮短發酵延滯期，在工業生產中節約能量和時間成本，具有經濟意義。

pET系統被廣泛用來表達外源重組蛋白質，構建時一般將目標蛋白基因置于T7啟動子下游，而T7啟動子只能由T7RNA聚合酶起始轉錄。T7RNA聚合酶具備高催化活力，它的轉錄速度比大腸桿菌內源的RNA聚合酶的轉錄速度快約8倍。當T7RNA聚合酶被充分誘導時，能夠利用細胞中的大部分材料來起始目的蛋白的轉錄，且在數小時后，目標蛋白能夠超過細胞總蛋白的50％。

蛋白質的表達有復雜性，不容易理性設計。當缺乏足夠的理論知識和經驗來改造具有更高性能的蛋白質生產菌株時，可以使用進化方法分離這樣的變異菌株，即通過選擇或篩選具有更優生產特性的遺傳突變株。通過該策略可以獲得一些與外源蛋白質高表達相關的突變位點，用于構建下一代蛋白表達底盤細胞。因此，挖掘與新型表達宿主需鈉弧菌蛋白質高表達相關的新靶點可以幫助科研人員優化需鈉弧菌蛋白質表達系統。

然而，到目前為止，尚沒有研究報道使用篩選方法分離出需鈉弧菌蛋白質高產突變株、以及提高pET系統蛋白質表達的有效突變。

發明內容

考慮到需鈉弧菌是目前生長最快的自由生活菌，有望成為下一代細胞工廠用于蛋白質高效表達，通過誘變和高通量篩選技術，或許能夠強化T7RNA聚合酶的表達，這對于增加外源重組蛋白(甚至包括外源毒性蛋白)表達是有利的。出于該目的，發明人通過對需鈉弧菌VnDX進行紫外誘變和流式細胞分選技術，發現幾株對外源蛋白表達水平提高的突變菌株基因組中RNA聚合酶β’亞基發生了突變，在獲得的誘變菌株中導入某些蛋白質的pET表達質粒后，發現重組菌株生產這些蛋白質的能力更強，獲得了更高的充足蛋白質產量。這一發現構成了本發明的基礎，具體而言，本發明包括如下技術方案：

一種RNA聚合酶突變體，其為細菌RNA聚合酶β’亞基rpoC發生第457位酪氨酸(Y或Tyr)突變所形成的突變體。所述的突變選自酪氨酸(Y)被其他氨基酸替換、缺失、或者化學修飾。優選是降低rpoC活性的突變體，即rpoC發生負向突變。

在一種實施方式中，上述酪氨酸(Y)突變是指酪氨酸(Y)突變為其他氨基酸(X)，該情況下該突變體可簡稱為rpoCY457X，所述其他氨基酸(X)選自下組：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、纈氨酸(V)，從而使RNA聚合酶β’亞基rpoC成為RNA聚合酶β’亞基rpoC突變體。

優選地，上述酪氨酸(Y)突變是酪氨酸(Y)突變為選自下組的氨基酸：組氨酸(H或His)、亮氨酸(L或Leu)、纈氨酸(V或Val)、丙氨酸(A或Ala)、甲硫氨酸(M或Met)、半胱氨酸(C或Cys)或者絲氨酸(S或Ser)。

其中，RNA聚合酶β’亞基rpoC的氨基酸序列為SEQ ID NO:1：