[發明專利]一種生產香葉基香葉醇釀酒酵母工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202011508479.1
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112501043B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 石貴陽;王均華;李由然;朱惠霖;張梁;丁重陽;徐沙;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/04;C12R1/865
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

本發明公布了一種生產香葉基香葉醇的釀酒酵母工程菌的構建和應用，屬于合成生物學技術領域。本發明篩選獲得了在釀酒酵母中轉化效率較高的香葉基香葉基焦磷酸合成酶PaGGPPs。表達tHMG1、PaGGPPs?ERG20和PaGGPPs?DPP1可促進香葉基香葉醇的積累。表達CHK1和IPK1，同時缺損ROX1基因可進一步促進香葉基香葉醇的積累。本發明構建的基因工程菌搖瓶發酵最高能夠積累0.77g/L香葉基香葉醇，5L發酵罐120h能夠積累4.3g/L香葉基香葉醇。

技術領域

本發明屬于合成生物學領域，尤其是涉及一種生產香葉基香葉醇釀酒酵母工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

香葉基香葉醇(geranylgeraniol)，香精油香氣成分之一，被用作香水生產的佐料，同時被用作生產疏水性維生素和藥劑的原材料。微生物因其生長迅速、合成特異性強、底物成本低等優點成為香葉基香葉醇合成研究重點。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是最簡單的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技術和內源性甲羥戊酸途徑的存在使釀酒酵母成為了萜類化合物合成研究的熱點。為了提高香葉基香葉醇前體香葉基香葉基焦磷酸的供給，有報道香葉基香葉基焦磷酸合酶的效率是二萜化合物合成的一個限速步驟，過表達BTS1-ERG20和BTS1-DPP1可以促進香葉基香葉醇的積累。同時，也有報道過表達HMG-CoA還原酶活性區域編碼基因(tHMG1)可以提高異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的供給。到目前為止，沒有報道同時表達外源香葉基香葉基焦磷酸合酶編碼基因和兩步法合成異戊烯基焦磷酸編碼基因對釀酒酵母香葉基香葉醇合成的影響。

發明內容

本申請針對現有技術的不足，本發明提供了一株生產香葉基香葉醇釀酒酵母工程菌及其構建方法與應用。本發明制備得到釀酒酵母工程菌生產香葉基香葉醇具有較高產率。本發明的技術方案如下：

一種釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母工程菌染色體整合表達強化甲羥戊酸途徑基因、香葉基香葉基焦磷酸合酶編碼基因和兩步法合成異戊烯基焦磷酸編碼基因，同時缺損甲羥戊酸途徑和甾醇合成途徑轉錄抑制因子編碼基因；

所述甲羥戊酸途徑基因為tHMG1；

所述甲羥戊酸途徑基因為雙拷貝；

所述香葉基香葉基焦磷酸合酶編碼基因為PaGGPPs-ERG20和PaGGPPs-DPP1；

所述兩步法合成異戊烯基焦磷酸編碼基因為CHK1和IPK1；

所述整合表達均使用GAL啟動子；

所述缺損甲羥戊酸途徑和甾醇合成途徑轉錄抑制因子編碼基因為缺損ROX1基因。

所述釀酒酵母工程菌以釀酒酵母YPH499為宿主。

所述釀酒酵母工程菌以pMD-19T simple為整合表達載體。

所述PaGGPPs-ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs-DPP1的核苷酸序列為SEQ NO:2。

所述tHMG1的核苷酸序列為SEQ NO:3。

所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列為SEQNO:5；所述ROX1基因核苷酸序列為SEQ NO:6。

一種釀酒酵母工程菌的構建方法，所述構建方法如下：

通過整合表達強化甲羥戊酸途徑基因、香葉基香葉基焦磷酸合酶編碼基因和兩步法合成異戊烯基焦磷酸編碼基因，同時缺損甲羥戊酸途徑和甾醇合成途徑轉錄抑制因子編碼基因，最終制備得到所述釀酒酵母工程菌。

一種所述的釀酒酵母工程菌在生產香葉基香葉醇的應用。