[發(fā)明專利]一種體外耳蝸微器官功能單元及其三維構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011505389.7
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112608878B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文妍;夏明宇;李華偉;陳巖
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 天津市君硯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12239
• 代理人: 張東浩

1.一種體外耳蝸微器官功能單元的三維構(gòu)建方法，其特征是：包括以下步驟：

（1）將分離的Lgr5陽性耳蝸前體細(xì)胞三維培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)增殖成球，得到耳蝸類器官；

（2）三維共培養(yǎng)耳蝸類器官與螺旋神經(jīng)元，在培養(yǎng)體系因子作用下，形成毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)元連接的結(jié)構(gòu)即為耳蝸微器官單元；

步驟（1）中，耳蝸類器官為利用三維培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)Lgr5陽性的內(nèi)耳前體細(xì)胞克隆性增殖而來；

步驟（1）中，將分離的Lgr5陽性耳蝸前體細(xì)胞與含5vol%的Matrigel增殖培養(yǎng)基混懸形成三維培養(yǎng)7-8天，得到耳蝸類器官；其中，每1ml增殖培養(yǎng)基成分為DMEM/F-12 GlutaMAX培養(yǎng)基配置含有1.25mM的NAC、1X的N2、1X的B27、50ng/ml的EGF、50ng/ml的bFGF、50ng/ml的IGF、3μM的CHIR99021、10μM的Y-27632，待培養(yǎng)到第2天后，將10μM Y-27632換為2.5μM LPA，繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟（2）中，用Matrigel基質(zhì)膠包裹耳蝸類器官和螺旋神經(jīng)元，進(jìn)行三維共培養(yǎng)；

步驟（2）中，三維共培養(yǎng)時，調(diào)整耳蝸類器官和螺旋神經(jīng)元的位置，使螺旋神經(jīng)元類似體內(nèi)環(huán)形輻射神經(jīng)纖維端指向耳蝸類器官，并且維持兩者環(huán)形距離200-300μm；

步驟（2）中，三維共培養(yǎng)的時間為30天；

步驟（2）中，所述培養(yǎng)體系因子為每1ml的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，其成分為DMEM/F-12GlutaMAX培養(yǎng)基配置含有1.25mM的NAC、1X的N2、1X的B27、10ng/ml的bFGF、0.5μM的A83-01、100ng/ml的Shh、1μM的RA以及5μM的LY411575，待培養(yǎng)到第5天后，撤掉LY411575，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外耳蝸微器官功能單元的三維構(gòu)建方法構(gòu)建的耳蝸微器官單元，其特征是：具有感受編碼聲信號功能的耳蝸類器官毛細(xì)胞與接受聲信息轉(zhuǎn)化的電信號的螺旋神經(jīng)元組合在一起，并且具備兩種細(xì)胞之間的突觸連接，形成類似耳蝸的功能組織。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外耳蝸微器官功能單元的三維構(gòu)建方法構(gòu)建的耳蝸微器官單元的應(yīng)用，其特征是：在毛細(xì)胞再生相關(guān)研究、毛細(xì)胞損傷保護(hù)相關(guān)研究、內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)研究、聽覺相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究、遺傳性耳聾基因治療載體的篩選及相關(guān)研究或聽覺突觸重建相關(guān)研究中的應(yīng)用。