[發(fā)明專利]一種合成高純度甘油二酯的酶及其制備方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011504714.8
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN114645034A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 昝新藝;陳志蔚;陳宇星;崔鳳杰;葉萍萍;霍書豪;何文森
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇禾豐糧油工業(yè)有限公司;江蘇大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12P7/6454
• 代理公司: 鹽城創(chuàng)佳智科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32476
• 代理人: 卜祥奎

本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)和油脂加工和綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種合成甘油二酯的酶及其制備方法與應用；S2：重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以S1中獲得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列為模板，利用上游引物F和下游引物R擴增脂肪酶MRL基因，經(jīng)雙酶切后與質(zhì)粒pET30a連接，獲得重組質(zhì)粒pET30a?MRL。本發(fā)明制備的海洋細菌Malassezia restricta脂肪酶MRL具有良好的酯化活性，可以高效催化甘油和脂肪酸形成甘油一酯和甘油二酯，產(chǎn)物中甘油二酯含量達到30%?50%。產(chǎn)物經(jīng)過分子蒸餾后得到的高純度油脂中含有80?93%的甘油二酯，具有明顯的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)和油脂加工和綜合利用領(lǐng)域，特別是指一種合成甘油二酯的酶及其制備方法與應用。

背景技術(shù)

甘油二酯（Diacylcerol，DAG）是甘油中的兩個羥基與脂肪酸酯化形成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，主要包括1,2-DAG和1,3-DAG兩種異構(gòu)體，是公認安全（GRAS）的食品成分。甘油二酯的代謝途徑和甘油三脂不同，其被人體攝入后經(jīng)胰脂肪酶分解生成甘油和游離脂肪酸，可以直接轉(zhuǎn)化為能量，并不參與血脂合成，因而不會引起血脂升高、引發(fā)肥胖。因此，甘油二酯可以作為保健油脂、醫(yī)藥中間體，在食品、醫(yī)藥、化工行業(yè)具有非常重要的應用價值。

甘油二酯，大都是以動植物油、甘油和脂肪酸為原料，通過水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化、酸解、醇解等反應制備出的不同DAG含量的產(chǎn)品。通常，甘油二酯的制備方法有三種：水解法、甘油解法與酯化法。水解法是采用具有sn-1,3位特異性的脂肪酶適度水解精煉的動植物油脂獲得甘油二酯，此方法制得的油脂經(jīng)分子蒸餾純化后DAG含量通常不超過60%。甘油解法，是采用游離酶或固定化酶，以精煉動植物油脂與甘油為底物，在溶劑或無溶劑體系下進行甘油解反應，此方法制備出的油脂中DAG含量通常在50-85%之間，但是該反應受酶制劑的類型、溶劑、脂肪酶位置選擇性等條件制約因素較大。酯化法則是采用具有sn-1,3位特異性的脂肪酶或偏甘油酯脂肪酶，酯化甘油與脂肪酸獲得富含DAG的油脂，此法制得的DAG含量高達90%以上，尤其是通過偏甘油酯脂肪酶酯化制得的油脂，其DAG含量可達到97%以上。因此，酯化法生產(chǎn)高純度甘油二酯具有很大優(yōu)勢。

目前生產(chǎn)高純度甘油二酯的偏甘油酯脂肪酶來源極少，商業(yè)化的具有sn-1,3位特異性的偏甘油酯脂肪酶，該酶分別來自于嗜熱真菌Thermomyces lanuginosus和青霉菌Penicillium camemberti，均是通過發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)純化、干燥獲得的粉末狀游離型酶制劑，價格昂貴。國內(nèi)僅有文獻報道的偏甘油酯脂肪酶有脂肪酶SMG1、MgDL2和PCL等，但這些酶均未為應用于商業(yè)化生產(chǎn)甘油二酯。

為此，本發(fā)明提出一種合成高純度甘油二酯的酶及其制備方法與應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對國內(nèi)現(xiàn)有制備甘油二酯脂肪酶資源的不足，提出一種合成高純度甘油二酯的酶及其制備方法與應用，確定最佳合成甘油二酯的條件，豐富國內(nèi)用于酯化法生產(chǎn)甘油二酯的脂肪酶資源。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案。

一種合成高純度甘油二酯的酶的制備方法，步驟如下：

S1：通過合成海洋細菌Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因；

S2：重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以S1中獲得的Malassezia restricta脂肪酶MRL的基因序列為模板，利用上游引物F和下游引物R擴增脂肪酶MRL基因，經(jīng)雙酶切后與質(zhì)粒pET30a連接，獲得重組質(zhì)粒pET30a-MRL。

S3：脂肪酶MRL蛋白表達菌株的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒pET30a-MRL導入大腸桿菌BL21中，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，即為脂肪酶MRL蛋白表達菌株。

S4：脂肪酶MRL蛋白表達與純化：培養(yǎng)脂肪酶MRL蛋白表達菌株，誘導蛋白表達、純化、干燥獲得脂肪酶MRL干粉。