[發(fā)明專(zhuān)利]一種工程菌、含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011502613.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112522171A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王昕;張?jiān)圃?/a>;吳文娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江中山化工集團(tuán)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C12N9/80;C12N9/90;C12P13/10;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京天作專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11727
• 代理人: 王影

1.一種能夠表達(dá)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括編碼鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的核苷酸序列，其中，所述工程菌的構(gòu)建方法包括步驟，

構(gòu)建載體，將編碼鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的核苷酸序列亞克隆到載體上；

載體轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)宿主，獲得工程菌菌種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達(dá)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的工程菌，其特征在于，所述構(gòu)建載體還包括步驟，

選取引物，所述引物序列包括如SEQ ID:NO.3，SEQ ID:NO.4所述的核苷酸序列，

復(fù)制鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，通過(guò)PCR方法復(fù)制大腸桿菌MG1655上的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶序列。

3.一種含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，所述處理方法包括步驟，

獲得含鳥(niǎo)氨酸溶液，所述溶液包括D-鳥(niǎo)氨酸、L鳥(niǎo)氨酸，

培養(yǎng)如權(quán)利要求1或2所述的工程菌，獲得鳥(niǎo)氨酸脫羧酶粗酶液，

酶處理，向含鳥(niǎo)氨酸溶液中加入鳥(niǎo)氨酸脫羧酶粗酶液、磷酸吡哆醛，反應(yīng)生成終產(chǎn)物，所述終產(chǎn)物中包含D-鳥(niǎo)氨酸和/或丁二胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，培養(yǎng)如權(quán)利要求1或2所述工程菌的步驟包括，

單菌落培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)；再將該菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，接種量為L(zhǎng)B培養(yǎng)基體積的1-5％；

誘導(dǎo)表達(dá)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8-1.2mmol/L，25℃過(guò)夜培養(yǎng)；

收集粗酶液，離心收集菌體并破碎，得到鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的粗酶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)表達(dá)步驟中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度1.0mmol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，所述獲得含鳥(niǎo)氨酸溶液包括步驟，

構(gòu)建能夠表達(dá)鳥(niǎo)氨酸消旋酶的工程菌，所述工程菌包括SEQ ID:NO.1的核苷酸序列，

L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所述能夠表達(dá)鳥(niǎo)氨酸消旋酶的工程菌，利用菌體將L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為DL-鳥(niǎo)氨酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，所述培養(yǎng)能夠表達(dá)鳥(niǎo)氨酸消旋酶的工程菌的步驟包括，

單菌落培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)；再將該菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，接種量為L(zhǎng)B培養(yǎng)基體積的1-5％；

誘導(dǎo)表達(dá)，37℃培養(yǎng)2-3小時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8-1.2mmol/L，30℃過(guò)夜培養(yǎng)；

收集菌體，離心收集表達(dá)鳥(niǎo)氨酸消旋酶的基因工程菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含鳥(niǎo)氨酸溶液的處理方法，其特征在于，所述利用菌體將L-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為DL-鳥(niǎo)氨酸的步驟包括，

向pH為6-8的25-100mM磷酸鉀緩沖溶液中加入OD₆₀₀＝7-9的菌體細(xì)胞、以及L-鳥(niǎo)氨酸或其鹽酸鹽，反應(yīng)溫度為37℃、100-500r/min振蕩反應(yīng)，

在5000-20000rpm條件下，離心1-10min去除鳥(niǎo)氨酸消旋酶菌體細(xì)胞，上清液煮沸，滅活殘留的鳥(niǎo)氨酸消旋酶。

9.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含鳥(niǎo)氨酸脫羧酶粗酶液，

所述鳥(niǎo)氨酸脫羧酶粗酶液的制備方法包括步驟，

對(duì)如權(quán)利要求1或2所述的工程菌進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，置于37℃過(guò)夜培養(yǎng)；再將該菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，接種量為L(zhǎng)B培養(yǎng)基體積的1-5％；

誘導(dǎo)表達(dá)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度0.8-1.2mmol/L，25℃過(guò)夜培養(yǎng)；

收集粗酶液，離心收集菌體并破碎，得到鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的粗酶液。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括磷酸吡哆醛組分。