[發明專利]一種兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法

有效

• 申請號: 202011499864.4
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112501115B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 陳堅;周景文;李妹;雷慶子;關欣;余世琴;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法，屬于生物技術領域。本發明的分離純化方法包括取得無菌的肌肉組織，高效率的消化肌肉組織以得到大量的肌肉單核細胞以及通過percoll梯度純化獲得高純度的兔肌肉干細胞。應用本發明的純化方法，可以穩定的獲得純度超過90％(以CD56染色為陽性計)的兔肌肉干細胞。應用本發明的方法，為兔的肌肉干細胞的培養提供了有效的分離提取方法。

技術領域

本發明涉及一種兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法，屬于生物技術領域。

背景技術

近年來隨著我國社會經濟的飛速發展，肉類農產品的供求出現了嚴重的不平衡。傳統的畜牧業資源消耗多，對環境污染嚴重，還存在著動物福利與動物疫病等一系列問題，矛盾日益突出，亟需發展綠色的肉類生產技術。細胞培養肉是近些年興起的一項具有顛覆性的肉類生產技術，是依據動物肌肉生長修復機理，利用體外培養獲得肉類的一種技術。培養肉的生產首先需要獲得肌肉干細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞等種子細胞。其中最有前途的是肌衛星細胞，它們是肌肉的主要成體干細胞。

肌肉干細胞又稱為肌衛星細胞，是位于肌肉組織基膜和肌細胞膜之間的一類單核干細胞，一般處于靜息狀態。當受到刺激或者損傷時會被激活，通過增殖、分化為成肌細胞。一部分可以與其他成肌細胞融合為新的多細胞核肌管，從而形成肌纖維；另一部分自我更新補充干細胞，以保持自身數量穩定。肌肉干細胞經過分離提取可以實現體外培養，進行增殖、分化形成肌肉組織。肌肉干細胞培養首要需解決的問題就是在體外分離得到純度高的肌肉干細胞。近些年，對于大型哺乳動物豬、羊、牛等的肌肉干細胞的提取及培養有了系統的發展，而對于兔肌肉干細胞的提取分離并沒有具有很好效果的分離方法。

兔子作為一種肉食食材，口感細膩，肉質鮮嫩，受到了廣大消費者的青睞。兔肌肉干細胞的提取及分離也是細胞培養肉發展過程中重要的部分之一，如何將兔肌肉干細胞從肌肉組織中提取并純化，進而實現體外培養是培養出兔肉的關鍵步驟。據現有文獻報道，兔肌肉干細胞的分離主要有組織塊貼壁法和酶消化法，組織塊貼壁法污染較大，且肌肉干細胞所占比例低，成纖維細胞、骨骼肌細胞等雜細胞較多，純度低不適合兔肌肉干細胞的體外研究。傳統的酶消化法采用膠原蛋白酶Ⅰ消化或者與胰蛋白酶結合消化，但初生兔肌纖維間間隙較大,排列不緊密，其間分布有多個結締組織細胞，且兔肉筋膜較多，不易剔除，因此消化效率低、獲得的細胞量較少。在肌肉干細胞的純化方面，可采用差速貼壁法、密度梯度離心法、流式分選法。差速貼壁法雖然鑒別，但獲得的兔肌肉干細胞純度不高(40％)；流式分選法雖然能夠獲得較高純度的肌肉干細胞，但需要使用抗體，不僅成本高昂，并且針對兔肌肉干細胞的特異性表面標志物還未得到充分鑒定。Percoll密度梯度離心法根據不同類型細胞間細胞密度的差別將肌肉干細胞純化，是一種低成本、簡單、高純度分離肌肉干細胞的方法。Percoll溶液的濃度梯度決定了所分離細胞的數量和純度，已有文獻報道的分離兔肌肉干細胞采用的是80％和20％或60％和20％的percoll濃度，其溶液密度相差較大，純化率雖相較于差速貼壁法高，但仍低于70％，并不能滿足作為培養肉生產種子細胞的要求。因此，開發一種高效的、穩定的兔肌肉干細胞提取及分離純化方法具有重要的意義。

發明內容

針對現有的技術難點及存在的問題，本發明提供一種用于動物細胞培養肉或干細胞研究的兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法。

本發明第一個目的是提供一種兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法，所述方法包括如下步驟：

將兔碎肌肉組織置于含有膠原蛋白酶XI的基礎培養基中孵育消化；

將兔肌肉干細胞采用percoll濃度梯度90％，55％，40％，35％，27.5％進行純化。

本發明的一種實施方式，一種兔肌肉干細胞的提取分離及純化方法，包括如下步驟：

(1)兔肌肉干細胞提取

S1：選取七日齡的幼兔，采用CO₂安樂處死，在無菌環境下將兔解剖，除菌處理獲得兔肌肉組織；