[發明專利]一種人源CYP2D6*10轉基因小鼠模型的構建方法在審
| 申請號： | 202011499244.0 | 申請日： | 2020-12-17 |
| 公開（公告）號： | CN112626119A | 公開（公告）日： | 2021-04-09 |
| 發明（設計）人： | 陳冰冰;錢建暢;胡國新;李軍偉;肖健;林麗 | 申請（專利權）人： | 溫州醫科大學 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;A01K67/027;C12N15/53 |
| 代理公司： | 杭州知閑專利代理事務所(特殊普通合伙) 33315 | 代理人： | 張勛斌 |
| 地址： | 325036 浙江省溫州市甌海*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 cyp2d6 10 轉基因 小鼠 模型 構建 方法 | ||
1.一種構建人源化CYP2D6*10轉基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：利用同源重組原理，在小鼠的Cyp2d22基因exon4-5之間定點敲入人的CYP2D6*10(hCYP2D6*10)的表達框，獲得陽性克隆后再敲除Cyp2d基因簇，得到hCYP2D6*10基因打靶載體；進行打靶后得到Cyp2dKO陽性ES細胞，經擴增注入小鼠的囊胚，再將囊胚移入代孕小鼠體內進行繁育，獲得嵌合體小鼠；
所述hCYP2D6*10的核苷酸序列為列表中的序列1；
所述hCYP2D6*10基因打靶載體的序列為列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述hCYP2D6*10基因打靶載體經EcoRI限制性內切酶消化進行驗證，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，具有10478bp、8673bp、5617bp、2177bp、260bp5個條帶。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，hCYP2D6*10基因打靶后獲得的陽性ES細胞通過PCR進行鑒定，5’臂同源重組陽性克隆應擴增出3.6kb片段，陰性克隆應無產物；3’臂同源重組陽性克隆應擴增出6.0kb片段，陰性克隆應無產物。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用Crispr/Cas9技術敲除Cyp2d基因簇，Cyp2dKO陽性克隆利用PCR進行鑒定，KO陽性克隆應擴增出2.2kb片段，陰性克隆應無產物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，Crispr/Cas9技術所應用sgRNA序列為列表中的序列3和序列4。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述代孕小鼠為C57BL/6J小鼠，出生后得到F0代嵌合體小鼠，F0代小鼠進行雜交，從F1代小鼠中獲得hCYP2D6*10雜合或者純合轉基因小鼠。
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