[發(fā)明專(zhuān)利]一種改造乙酸梭菌代謝途徑產(chǎn)丙酮的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011498111.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112608935A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范立海;許亞麗;李灝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/74
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/74;C12P7/28;C12R1/145
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

一種改造乙酸梭菌代謝途徑產(chǎn)丙酮的方法屬于基因工程范疇。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乙酸梭菌中，將改造后的乙酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丙酮。其核心是構(gòu)建含有ThlA、ctfB、adc三個(gè)基因的重組質(zhì)粒，并使其能夠在乙酸梭菌中能夠表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物丙酮。本發(fā)明構(gòu)建了重組質(zhì)粒PIMP1?ThlA?ctfB?adc，并將其成功導(dǎo)入乙酸梭菌中表達(dá)產(chǎn)生丙酮。

技術(shù)領(lǐng)域

一種通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乙酸梭菌中，將改造后的乙酸梭菌能夠發(fā)酵產(chǎn)丙酮的方法，屬于基因工程范疇。

背景技術(shù)

微生物發(fā)酵的手段生產(chǎn)化學(xué)品成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，正因?yàn)槠渚哂泄?jié)能、環(huán)保，高效等優(yōu)點(diǎn)，符合黨的十九大提出的構(gòu)建清潔低碳、安全高效的能源體系的要求。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與世界的現(xiàn)代化，人類(lèi)對(duì)能源的依賴(lài)越來(lái)越大。上個(gè)世紀(jì)對(duì)化石能源的大量開(kāi)采和利用使化石能源與原料地接近枯竭，在化石燃料的加工和使用過(guò)程中，廢氣和肥料的排放會(huì)給環(huán)境帶來(lái)巨大的污染，燃料燃燒過(guò)程中產(chǎn)生的溫室氣體也給地球氣候帶來(lái)巨大的影響，思考如何生產(chǎn)可再生能源，如何減少溫室氣體，已成為越來(lái)越受關(guān)注的課題。

丙酮是化工生產(chǎn)中的重要原料，主要用作合成聚碳酸酯塑料所需的甲基丙烯酸甲酯和雙酚a的溶劑和前驅(qū)體。丙酮的全球生產(chǎn)以化石資源為基礎(chǔ)，并與苯酚生產(chǎn)、異丙苯工藝相結(jié)合。信息處理服務(wù)報(bào)告顯示，隨著世界人口的增長(zhǎng)，全球丙酮需求每年都在增長(zhǎng)。在認(rèn)識(shí)到石油作為一種資源的可消耗性以及二氧化碳污染對(duì)環(huán)境造成的持續(xù)壓力的同時(shí)，研究和工業(yè)界也在努力尋找生產(chǎn)大宗化學(xué)品和燃料的更具環(huán)境可持續(xù)性的工藝。

乙酸梭菌(Clostridium aceticum)是一種嚴(yán)格厭氧的乙酸產(chǎn)生菌，它既能以H₂+CO₂為能源和碳源自養(yǎng)生長(zhǎng)，又能以果糖、丙酮酸、延胡索酸為碳源異養(yǎng)生長(zhǎng)。C.aceticum可通過(guò)Wood-Ljungdahl途徑將H₂+CO₂轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，又可以通過(guò)糖酵解途徑將果糖轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并進(jìn)一步代謝產(chǎn)生乙酸。通過(guò)外源引入ThlA(硫解酶)、ctfB(丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶)、adc(乙酰乙酸脫羧酶)三個(gè)基因可將乙酰輔酶A進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮，從而實(shí)現(xiàn)丙酮的產(chǎn)生過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用基因工程技術(shù)改造了乙酸梭菌，使之可以產(chǎn)生丙酮。其核心是構(gòu)建含有ThlA、ctfB、adc三個(gè)基因的重組質(zhì)粒，并使其能夠在乙酸梭菌中能夠表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物丙酮。

一、重組質(zhì)粒PIMP1-ThlA-ctfB-adc的構(gòu)建過(guò)程，具體操作如下：

1、取保存的菌種丙丁梭菌接種于新鮮的CGM培養(yǎng)基，置于30℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，使菌種復(fù)蘇。

CGM培養(yǎng)基配方：(NH₄)₂SO₄ 2g、K₂HPO₄ 1g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、蛋白胨4g、酵母粉2g、葡萄糖20g、FeSO₄·7H₂O 0.015g、CaCl₂·2H₂O 0.015g、MnSO₄·H₂O 0.01g、CoCl₂ 0.02g、ZnSO₄ 0.002g，用去離子水補(bǔ)至1L。

2、將復(fù)蘇的丙丁梭菌接種于新鮮的CGM培養(yǎng)基，置于30℃恒溫箱培養(yǎng)12-16小時(shí)，離心收集菌體。使用細(xì)菌全基因組提取試劑盒提取丙丁梭菌的全基因組作為PCR擴(kuò)增DNA模板。

3、按照ThlA、CtfB、adc設(shè)計(jì)引物，上游引物為F,下游引物為R.具體如下所示。

ThlA-F cgggatcccgatgaaagaagttgtaatagc