[發(fā)明專利]本氏煙HAKAI基因在調控植物抗病毒中的應用及轉基因植物培育方法

有效

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• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112575003B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 李方方;何浩;周雪平
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

本發(fā)明公開了一種本氏煙HAKAI基因在調控植物抗病毒中的應用及轉基因植物培育方法，所述病毒為茄果花葉病毒，HAKAI基因的轉錄本序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明通過農桿菌轉化的方法，將HAKAI基因導入目的植物中，獲得了本氏煙HAKAI基因過表達植物。獲得的本氏煙HAKAI過表達植物能夠顯著減輕茄果花葉病毒的侵染。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種抑制茄果花葉病毒侵染的轉基因植物。

背景技術

茄果花葉病毒(Pepino mosaic virus,PepMV)屬于馬鈴薯X病毒屬病毒。1974年首次在秘魯鳳果中分離得到該病毒。在此之后，歐洲、北美、南美、南非及亞洲地區(qū)都有發(fā)現該病毒，現已成為溫室番茄的重要病害。PepMV主要侵染番茄、茄子、馬鈴薯等茄科蔬菜，也能侵染莧屬植物、金盞花、南茼蒿、田旋花、小花錦葵、光煙草、龍葵、苦苣菜、墻生藜、白酒草、野生劍生菜、羅勒、酸模屬植物、水蒜芥、蒲公英等植物。

PepMV侵染番茄后，可導致番茄果實斑駁、變色、裂果、葉片花葉、扭曲、起泡、葉莖維管組織壞死，甚至全株死亡，嚴重影響番茄的產量和品質。PepMV具有高度傳染性，可以通過污染的工具、手和衣物以及植物間直接接觸等方式進行傳播，一旦發(fā)生將很難遏制。目前該病毒已在我國云南地區(qū)普遍發(fā)生。

農業(yè)衛(wèi)生預防是生產中控制PepMV的重要措施。但是由于該病毒具有高度傳染性，這就使得農業(yè)衛(wèi)生措施預防病毒成為挑戰(zhàn)，尤其是在密集的大田和保護地。交叉保護是預防病毒的另一重要手段。但是由于該病毒基因型分化等原因，效果有限，甚至還會出現病毒癥狀更重的情況。此外，生產上缺少抗PepMV的植物遺傳材料。因此，目前還沒有有效的控制PepMV的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的第一目的是提供一種本氏煙HAKAI基因在調控植物抗病毒中的應用。

本發(fā)明的第二目的是提供一種本氏煙HAKAI高表達植物的培育方法。

本發(fā)明發(fā)現了本氏煙中HAKAI基因是一個抗病基因。通過農桿菌轉化的方法，將HAKAI基因導入目的植物中，獲得的本氏煙HAKAI高表達植物能夠顯著減輕PepMV的侵染，有效控制該病毒的危害。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案具體如下：

本氏煙HAKAI基因在調控植物抗病毒中的應用，其中，所述病毒為茄果花葉病毒。所述HAKAI基因的轉錄本序列如SEQ ID NO:1所示。

具體的，是通過農桿菌轉化的方法，將HAKAI基因導入目的植物中，獲得的本氏煙HAKAI高表達植物能夠顯著減輕茄果花葉病毒的侵染，抑制茄果花葉病毒造成的病害。

一種抗茄果花葉病毒的HAKAI轉基因植物的培育方法：通過農桿菌轉化的方法，將HAKAI基因導入目的植物中，獲得本氏煙HAKAI基因高表達植物。

具體包括以下步驟：

(1)本氏煙草葉片取樣，Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)₁₈(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')引物反轉錄獲得cDNA；

(2)使用引物對NbHAKAI-F與NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA為模板進行PCR擴增，克隆得到NbHAKAI，

NbHAKAI-F：atgcttcagatccggctaag；

NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；

(3)將NbHAKAI構建到帶有YFP熒光標簽的載體上，獲得YFP-NbHAKAI重組質粒；