[發明專利]Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系的構建及誘導分化方法

有效

• 申請號: 202011493656.3
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112746074B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 劉軍;鐘亞丹;榮知立;楊斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學皮膚病醫院（廣東省皮膚病醫院;廣東省皮膚性病防治中心;中國麻風防治研究中心）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;C12N15/90;C12N5/071
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

本發明公開了Keratin 5?IRES?eGFP敲入的hESCs細胞系的構建及誘導分化方法。具體方法為：構建sgRNA質粒，根據sgRNA切割位點構建打靶Doner載體，將cas9質粒，sgRNA質粒，打靶Doner載體共電轉至hESCs細胞，得到初步陽性單克隆細胞系后電轉表達cre酶的質粒，通過PCR跑膠和測序得到最終Keratin 5?IRES?eGFP敲入的hESCs細胞系。誘導分化hESCs細胞為角質形成細胞從而得到Keratin 5陽性的基底層角質形成細胞。該細胞系的建立有利于篩選出Keratin 5陽性的基底層角質形成細胞，從而為臨床上表皮基底角質形成細胞異常的皮膚病研究提供細胞模型。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及的Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系的構建方法和應用。

背景技術

人胚胎干細胞(Human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。在體外或體內環境，hESCs細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。

基底層角質形成細胞(basal keratinocyte)位于表皮最底層細胞，目前認為該類細胞處于分裂活躍狀態，經過分化最終變成角質層的無細胞核鱗狀細胞，基底層角質形成細胞通過不斷地自我更新得以維持表皮的屏障作用。而現有的技術方法難以將基底層角質形成細胞分離培養，使得對其的研究和應用受到限制。

細胞角蛋白(cytokeratin)是上皮細胞中發現的一大類細胞骨架蛋白，是構成生皮表皮、毛皮毛囊的主要蛋白質。角蛋白可保護上皮組織細胞免受損傷或壓力。現已發現的角蛋白肽鏈超過20種，毛角蛋白和表皮角蛋白分別由不同的角蛋白膚鏈構成。其中角蛋白5(keratin 5)發現在復層鱗狀上皮細胞如舌粘膜,以及基底氣管上皮細胞,基底層角質形成細胞，毛囊，皮膚的皮脂和汗腺,腔的乳腺細胞等均有表達，基底層角質形成細胞表達角蛋白14(keratin 14)和角蛋白5(keratin 5)，因此角蛋白14和角蛋白5可作為基底層角質形成細胞的標志物。然而現有文獻并沒有報道相關的利用標志物對基底層角質形成細胞分離培養成功的技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種Keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細胞系的構建方法及誘導分化方法，將該細胞系誘導分化為角質形成細胞后可標記Keratin 5陽性的表皮基底層角質形成細胞，從而通過細胞流式(flow cytometry，FCM)技術將其分選出來。

本發明解決技術問題的方案如下：

一種靶向Keratin 5終止密碼子下游的sgRNA，其具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

一對具有與目的基因Keratin 5下游斷裂位點上下游相同序列的同源臂，包括與目的基因Keratin 5下游斷裂位點上游相同序列的上游同源臂Keratin 5 Arm1，如SEQ IDNO.2所示，以及包括與目的基因Keratin 5下游斷裂位點下游相同序列的下游同源臂Keratin 5 Arm2，如SEQ ID NO.3所示。

一種待重組入基因組靶位點的IRES-eGFP，其DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

一種打靶Donor載體Keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo，其具有與目的基因Keratin5下游斷裂位點上游相同序列的上游同源臂Keratin 5 Arm1，以及與斷裂位點下游相同序列的下游同源臂Keratin 5 Arm2，上游同源臂、下游同源臂之間是待重組入基因組靶位點的IRES-eGFP的DNA片段，Keratin 5 Arm1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，Keratin 5 Arm2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，IRES-eGFP的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。