[發明專利]用于分離提取人的椎間盤干細胞的培養基、制備方法及椎間盤干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202011493206.4
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112410293A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 劉萍;張贊
• 申請（專利權）人: 北京中潤天泓生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京市商泰律師事務所 11255
• 代理人: 鄒芳德

1.一種用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基，其特征在于，包括如下成分：低糖達爾伯克氏改良伊格爾DMEM培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清、抗生素、重組成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素、乙酰半胱氨酸和甲狀腺原氨酸。

2.根據權利要求1所述的用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基，其特征在于：低糖達爾伯克氏改良伊格爾DMEM培養基與DMEM/F12培養基的體積比為1:1，低糖達爾伯克氏改良伊格爾DMEM培養基與DMEM/F12培養基的體積之和占所述椎間盤間充質干細胞的培養基總體積的百分比為89％。

3.根據權利要求1所述的用于分離提起人的椎間盤間充質干細胞的培養基，其特征在于：添加胎牛血清的體積百分比為6％、抗生素體積百分比為1％、重組成纖維生長因子濃度為2-10ng/ml、表皮生長因子濃度為2-10ng/ml、胰島素濃度為10ug/ml、乙酰半胱氨酸濃度為2mM、甲狀腺原氨酸濃度為10ng/ml。

4.根據權利要求1所述的用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基，其特征在于：所述抗生素為青霉素和鏈霉素的混合物。

5.一種如權利要求1-4任一項所述的用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基的制備方法，其特征在于：在445ml低糖達爾伯克氏改良伊格爾培養基中加入50ml胎牛血清、抗生素青霉素和鏈霉素5ml、重組人成纖維生長因子2.5ug、表皮生長因子2.5ug、胰島素5mg、乙酰半胱氨酸2.5ml、甲狀腺原氨酸5ug，0.22μm濾器過濾除菌，4℃儲存備用。

6.一種利用如權利要求1-5任一項所述的用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基進行椎間盤間充質干細胞培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S110：將無菌條件下獲取的人椎間盤組織剪碎后用冰磷酸鹽緩沖液PBS混合后離心；

步驟S120：加入用I型和II膠原酶混合物消化、離心；

步驟S130：使用用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基重懸單個細胞后水浴；

步驟S140：再次用用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基重懸、過濾后移入培養瓶中；

步驟S150：連續培養5-7天后，干細胞成克隆生長后，用普通培養基可傳代持續培養。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟S110中，用4℃的冰磷酸鹽緩沖液混合切碎的椎間盤組織后低速離心。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟S120中，使用混合的I型和II型膠原酶消化，I型和II型膠原酶質量比為1:1。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：混和膠原酶和磷酸鹽緩沖液的總體積分數比為1:1000，每克椎間盤組織使用1ml膠原酶-磷酸鹽緩沖液消化，振蕩水浴消化時間為0.5-2小時，消化時水浴溫度為37℃。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述步驟S130中，消化后的單細胞用用于分離提取人的椎間盤間充質干細胞的培養基重懸，放入37℃水浴中靜置15分鐘。