[發(fā)明專利]利用生物多酶偶聯(lián)法制備L-草銨膦的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011491692.6
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112626142B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏東芝;王華磊;吳承駿;劉清海;羅中華;張長雷
• 申請（專利權(quán)）人: 永農(nóng)生物科學(xué)有限公司;華東理工大學(xué);寧夏永農(nóng)生物科學(xué)有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 北京市中倫律師事務(wù)所 11410
• 代理人: 劉烽

1.一種制備L-草銨膦的方法，其包括：

a)在(R)-轉(zhuǎn)氨酶和氨基受體的存在下，使D,L-草銨膦發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸和氨基受體的加氨基產(chǎn)物；

b)在(S)-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體的存在下，使步驟a)中得到的2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到L-草銨膦和氨基供體的脫氨基產(chǎn)物，

其中所述方法在同一反應(yīng)器中進(jìn)行，

其中步驟a)中另外存在能夠使所述氨基受體的加氨基產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所述氨基受體的催化酶，并且所述催化酶為D-氨基酸氧化酶，

其中步驟b)中另外存在能夠除去所述氨基供體的脫氨基產(chǎn)物的催化酶，并且所述催化酶為丙酮酸脫酸酶，

其中步驟a)中的所述氨基受體為丙酮酸，所述氨基受體的加氨基產(chǎn)物為D-丙氨酸，

其中步驟b)中的所述氨基供體為L-丙氨酸，所述氨基供體的脫氨基產(chǎn)物為丙酮酸，

其中在步驟a)中，反應(yīng)開始時氨基受體與D,L-草銨膦的摩爾比為1:500-1:5，

其中所述(R)-轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列為SEQ ID No.1，并且

其中所述(S)-轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列為SEQ ID No.7。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列為SEQ IDNo.3。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟a)之后和步驟b)之前還包括加熱步驟，所述加熱步驟使步驟a)的反應(yīng)混合物中的酶滅活。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a)的反應(yīng)中另外存在過氧化氫酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述(R)-轉(zhuǎn)氨酶、(S)-轉(zhuǎn)氨酶、能夠使所述氨基受體的加氨基產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所述氨基受體的催化酶、能夠除去所述氨基供體的脫氨基產(chǎn)物的催化酶和所述過氧化氫酶的形式各自獨(dú)立地選自：部分純化的酶；無細(xì)胞提取物或粗細(xì)胞提取物；液體、粉末或固定形式；含有酶的可透化處理的細(xì)胞、完整細(xì)胞或完整發(fā)酵液、凍干細(xì)胞或其任何組合。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法的步驟a)包括：

a)在共表達(dá)(R)-轉(zhuǎn)氨酶和能夠使所述氨基受體的加氨基產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所述氨基受體的所述催化酶的第一重組微生物和氨基受體的存在下，使D,L-草銨膦發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸并使得到的所述加氨基產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所述氨基受體。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法的步驟b)包括：

b)在共表達(dá)(S)-轉(zhuǎn)氨酶和能夠除去所述氨基供體的脫氨基產(chǎn)物的催化酶的第二重組微生物和氨基供體的存在下，使2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到L-草銨膦并除去得到的所述脫氨基產(chǎn)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一重組微生物和第二重組微生物各自獨(dú)立地選自：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolitica)、克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)或大腸桿菌(Escherichia coli)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，以濕菌體重量計(jì)，所述第一重組微生物的添加量為5-200g濕菌體/L反應(yīng)液，或者，以干菌體重量計(jì)，所述第一重組微生物的添加量為1-50g干菌體/L反應(yīng)液。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，以濕菌體重量計(jì)，所述第二重組微生物的添加量為5-200g濕菌體/L反應(yīng)液，或者，以干菌體重量計(jì)，所述第二重組微生物的添加量為1-50g干菌體/L反應(yīng)液。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)和b)的反應(yīng)在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。