[發(fā)明專利]袖珍椰子葉綠體基因組及種質(zhì)的鑒定方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011490172.3 | 申請日： | 2021-02-02 |
| 公開（公告）號： | CN112501270A | 公開（公告）日： | 2021-03-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 賀俐;吳楊;龍婉婉;易小妹 | 申請（專利權(quán)）人： | 井岡山大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 南昌大牛知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 36135 | 代理人： | 喻莎 |
| 地址： | 343000 江*** | 國省代碼： | 江西;36 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 袖珍 椰子 葉綠體 基因組 種質(zhì) 鑒定 方法 | ||
1.一種袖珍椰子葉綠體基因組及種質(zhì)的鑒定方法，其特征在于：所述基因組及種質(zhì)的鑒定方法包括以下步驟：
(1)植物DNA的提取
將植物新鮮葉片用液氮充分研磨，利用改良的CTAB法提取袖珍椰子及其近緣物種DNA；
(2)葉綠體基因組測序
樣品基因組DNA檢測合格后，用超聲波將DNA片段化，然后對片段化的DNA進行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Novaseq平臺進行測序；
(3)測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制
使用fastp v0.20.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾，過濾后獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)；
(4)基因組測序數(shù)據(jù)的組裝
使用bowtie2 v2.2.4very-sensitive-local模式比對NCBI葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，將比對上的測序序列當做樣品的葉綠體基因組測序序列，組裝核心模塊采用SPAdes v3.10.1軟件組裝葉綠體基因組，kmer分別使用55、87、121，組裝不依賴參考基因組；
(5)葉綠體基因組圖譜
使用OGDRAW制作葉綠體基因組圖譜；
(6)袖珍椰子及其近緣物種的種質(zhì)鑒定
以設(shè)計的Primer1和Primer2為擴增引物，利用所提取的DNA為模板，進行PCR擴增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因組及種質(zhì)的鑒定，其特征在于：所述步驟(1)的改良CTAB法是將植物葉片在液氮中磨成粉末，取0.1g粉末轉(zhuǎn)移到2mL微量離心管中，加入630μL預(yù)熱到65℃的1.5倍CTAB緩沖液，加入70μL無水乙醇，然后在65℃的水浴鍋中加熱30min，中間需搖動4-5次，取出微量離心管冷卻，然后加入700μL氯仿：異戊醇＝24：1混合均勻，10000rpm離心10min，取上清液至新的微量離心管中，加入2/3上清液體積的異丙醇，混勻，沉淀靜置，4000rpm離心3min，取上清液，或直接挑出絲狀DNA洗滌，加入500μL 76％乙醇洗滌2次，置于超凈工作臺吹干，加入100μL TF緩沖液或ddH2O溶解DNA，加入20μg/L核糖核酸酶，37℃消化30min，加入等體積氯仿：異戊醇＝24：1混合均勻，1000rpm離心10min，加入2倍體積的無水乙醇，混合均勻，沉淀，加入500μL乙醇洗滌2次，置于超凈工作臺吹干，加入50μL ddH20溶解DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因組及種質(zhì)的鑒定，其特征在于：所述步驟(2)葉綠體的測序讀長為PF150。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因組及種質(zhì)的鑒定，其特征在于：所述步驟(3)的過濾標準為：截除Reads中的測序接頭以及引物序列，過濾掉平均質(zhì)量值小于Q5的reads，過濾掉N個數(shù)大于5的reads。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因組及種質(zhì)的鑒定，其特征在于：所述步驟(4)的基因組測序數(shù)據(jù)的組裝包括以下步驟：
(1)SPAdes軟件組裝cpDNA序列得到葉綠體基因組的SEED序列；
(2)kmer iterative extend seed，若步驟(2)的結(jié)果為一條contig，則結(jié)果定為pseudo genome序列，直接進行步驟(6)；
(3)使用SSPACE v2.0軟件，將步驟(2)得到的contig序列進行連接得到scaffolds；
(4)使用Gapfiller v2.1.1軟件，對步驟(3)得到的scaffolds序列進行補GAP；
(5)如果上述操作結(jié)束后依然有6AP，設(shè)計引物、PCR測序、再組裝直至得到完整的pseudo genome序列；
(6)將測序序列比對到pseudo genome，進行基因組校正；
(7)根據(jù)葉綠體的結(jié)構(gòu)，將校正后pseudo genome，進行坐標重排，得到完整的葉綠體環(huán)狀基因組序列。
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