[發明專利]一種基于雞白痢沙門氏菌X蛋白包被的抗體ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 202011487568.2
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112649606A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 尹麗萍;張凱云;楊銅;戎雙琳;張瑤;牟抑揚;劉岳龍;張進;程立力
• 申請（專利權）人: 江蘇立華牧業股份有限公司;江蘇興牧農業科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N27/62;C07K14/255
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 曹坤

1.一種基于雞白痢沙門氏菌X蛋白包被的抗體ELISA檢測方法，其特征在于，具體操作步驟如下：

步驟(1)、通過制備和純化雞白痢沙門氏菌的SPF雞源高親和力多克隆抗體，采用免疫共沉淀方法篩選優勢抗原X蛋白；

步驟(2)、比對免疫共沉淀質譜得到的優勢抗原X蛋白；

步驟(3)、優勢抗原X蛋白的構建、表達和純化；

步驟(4)、間接ELISA方法的建立。

2.根據權利要求1所述的一種基于雞白痢沙門氏菌X蛋白包被的抗體ELISA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(1)中，

通過采用免疫共沉淀方法篩選優勢抗原X蛋白的具體操作步驟如下：

(1.1)、陰性雞血清制備：采集SPF雞血清作為陰性雞血清備用；

(1.2)、陽性雞血清制備：將LHSP001雞白痢沙門氏菌進行復蘇并擴培，口服感染SPF雞，進行采血檢測，收集薄板凝集抗體陽性雞血清；并玻板凝集陽性血清；

(1.3)、抗體純化：將陰、陽性雞血清采用飽和硫酸銨法進行純化、透析脫鹽，-70℃保存備用；

(1.4)、抗原復合物制備：將擴培的LHSP001雞白痢沙門氏菌用1xPBS重懸洗滌后離心，按1g濕菌加4ml細菌裂解液進行溫和裂解，4℃作用30min后，分別加入RNase A和DNase I；再4℃作用30min，最后加入PMSF，離心取上清，-70℃保存備用；

(1.5)、免疫共沉淀：

(1.5.1)、取ProteinA/G 50ul加入EP管中，加500ul1XPBS洗滌，磁性分離，重復2次，先加入40ug/ml兔抗雞抗體500ul，上下顛倒孵育30min后再加入純化好的雞IgG,4℃顛倒孵育8h；

(1.5.2)、同步取ProteinA/G 50ul加入EP管中，加500ul1XPBS洗滌，磁性分離，重復2次，加入制備好的抗原復合物1ml，4℃顛倒孵育4h后，得到去除非特異性結合后的抗原復合物；

(1.5.3)、對孵育好的樣本進行磁性分離，加500ul1XPBS洗滌，重復2次，再加入去除非特異性結合后的抗原復合物，4℃顛倒孵育8h；

(1.5.4)、磁性分離后，棄上清，加500ul1XPBS洗滌，磁性分離，重復2次，加入200ul0.1Mglycine，PH2.5，孵育5-7min，磁性分離收集上清；

(1.5.5)、提取30ul跑蛋白電泳膠進行定性分析并記錄；將剩余跑蛋白電泳膠進行質譜鑒定；

(1.5.6)、對進行質譜鑒定的質譜結果梳理分析，并將免疫共沉淀得到的蛋白進行生物信息分析，最終篩選出優勢抗原X蛋白。

3.根據權利要求1所述的一種基于雞白痢沙門氏菌X蛋白包被的抗體ELISA檢測方法，其特征在于，在所述步驟(2)中，

比對免疫共沉淀質譜得到的優勢抗原X蛋白的具體操作步驟如下：

(2.1)、取LHSP001雞白痢沙門氏菌甘油菌10μL接種5mlLB液體培養基，37℃振搖過夜；

(2.2)、按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組后送生工測序；

(2.3)、比對免疫共沉淀質譜得到的優勢抗原X蛋白與測序序列，結果一致。