[發(fā)明專利]一種促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011484537.1
• 申請日: 2020-12-16
• 公開（公告）號: CN112546129A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 匡建軍;蔡萍;戎寬;匡浩銘;楊惠;胡余飛;曹閑雅;譚學(xué)松;沈琳玲
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南省中醫(yī)藥研究院
• 主分類號: A61K36/87
• 分類號: A61K36/87;A61K9/06;A61H7/00;A01K67/02;C12N5/077;A61P19/08;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 北京動力號知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11775
• 代理人: 張盼

1.一種促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1、建立動物性KOA模型；

步驟2、按照人和動物體表面積換算出動物體表面積比率，確定所用動物膝關(guān)節(jié)處所需鐵包金按摩膏的用量，并在動物膝關(guān)節(jié)處采用刮痧法涂抹相關(guān)量的鐵包金按摩膏；

步驟3、間隔一日重復(fù)步驟2，重復(fù)次數(shù)為8-12次。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟2中的刮痧法具體操作步驟具體包括：

(1)單手握持刮痧板，將板放置掌心，一側(cè)由拇指固定，另一側(cè)由食指和中指固定，遠心端與皮膚呈45°沿下肢長軸方向從上向下刮拭，移動范圍在5cm以內(nèi)，力度以皮色不變，可有輕微發(fā)熱感而無皮膚破損為度，約為20-30N；

(2)刮痧頻率為20-40次/分鐘，操作時間平均8-10min，刮至皮膚微微發(fā)紅，不出丘疹點即可。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟1中的動物性KOA模型的具體建立方法具體包括：

(1)將動物固定在仰臥位，并固定雙后肢，再進行耳緣靜脈注射麻醉，右后膝內(nèi)側(cè)部備皮后，微屈膝關(guān)節(jié)，用碘伏消毒；

(2)以髕骨內(nèi)側(cè)下緣為進針點，消毒后使用注射器穿刺，將針頭沿穿刺點送入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再將相應(yīng)劑量的木瓜蛋白酶溶液注入，于造模開始第1、4、7天注射，每天一次，總共3次；

(3)術(shù)后分籠飼養(yǎng)，注意觀察動物的飲食等情況，定期驅(qū)趕動物20-40min/次，造模2周后即可出現(xiàn)KOA改變；

(4)造模8周后隨機從模型組中取一只模型動物進行空氣栓塞處死，暴露雙膝關(guān)節(jié)，切斷交叉韌帶，去除半月板，大體觀察對比股骨髁及脛骨平臺軟骨情況，當(dāng)模型動物膝關(guān)節(jié)可見軟骨表面變白、粗糙、缺損，有明顯關(guān)節(jié)腔積液，證明兔KOA造模成功。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟2中的鐵包金按摩膏的成分包括鐵包金、大黃、生川烏、生草烏、木瓜、木鱉子、肉桂、白蘞、赤芍、透骨草、乳香和沒藥。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟3結(jié)束后所用KOA模型中的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞是否增殖及增殖量的判斷是先采用軟骨細胞分離和培養(yǎng)，然后采用甲苯胺染色鑒定軟骨細胞，最后再采用Western-Blot印跡分析檢測TRPV6蛋白、Sox9蛋白表達情況；檢測TRPV6蛋白、關(guān)節(jié)軟骨細胞細胞外基質(zhì)中COL-Ⅰ、COL-Ⅱ的表達情況；檢測Sox9蛋白、關(guān)節(jié)軟骨細胞細胞外基質(zhì)中COL-Ⅹ的表達情況，采用CCK-8法檢測軟骨細胞增殖。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的促進膝關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的方法，其特征在于，所述軟骨細胞分離和培養(yǎng)的具體操作包括：

(1)從關(guān)節(jié)處分離出軟骨組織，用銳剪刀將其剪成體積小于1mm³的組織塊；

(2)用含雙抗的冷PBS液反復(fù)吹打清洗2-3次，靜置后，棄去上層液體及漂浮組織，將剩余組織移入離心管中，往離心管中加3倍體積的0.25％胰蛋白酶，置入30-40℃的恒溫搖床中，振蕩消化15-20分鐘，靜置5-10分鐘；

(3)棄上清，加入0.2％膠原酶II，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化30-60分鐘；將消化過的組織通過100μm細胞篩過濾，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗標(biāo)本，按照20000個/cm²的密度接種于組織培養(yǎng)瓶中，接著加入5-10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含1％青霉素/鏈霉素，放入37℃、體積分數(shù)5％CO₂、95％濕度的恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)培養(yǎng)2天后換液，以后每隔2-3天換1次液。