[發(fā)明專利]一種藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011484524.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN112666351A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡建軍;蔡萍;戎寬;匡浩銘;楊惠;胡余飛;曹閑雅;譚學(xué)松;沈琳玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南省中醫(yī)藥研究院
• 主分類號(hào): G01N33/573
• 分類號(hào): G01N33/573;G01N33/68;G01N1/28;G01N1/36;G01N21/84
• 代理公司: 北京動(dòng)力號(hào)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11775
• 代理人: 張盼

1.一種藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、建立兔KOA模型；

步驟二、采用藥刮法對(duì)兔的膝關(guān)節(jié)定期涂抹鐵包金按摩膏；

步驟三、制備動(dòng)物標(biāo)本；

步驟四、對(duì)標(biāo)本中的軟骨組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；

步驟五、對(duì)軟骨組織中的caspase-3、caspase-9及XIAP蛋白免疫組化檢測(cè)。

2.權(quán)利要求1所述的藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟1中的兔KOA模型具體建立步驟包括：

(1)將兔固定在仰臥位，并固定雙后肢，于右后膝內(nèi)側(cè)備皮，微屈膝關(guān)節(jié)，以髕骨內(nèi)側(cè)下緣為進(jìn)針點(diǎn)，消毒后使用1ml注射器穿刺，將針頭沿穿刺點(diǎn)送入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，再將0.1ml的4％木瓜蛋白酶溶液注入，于造模開始第1、4、7天，每天注射一次，共注射3次；

(2)造模2周后隨機(jī)取一只模型兔進(jìn)行空氣栓塞處死，暴露雙膝關(guān)節(jié)，切斷交叉韌帶，去除半月板，大體觀察對(duì)比股骨髁及脛骨平臺(tái)軟骨情況，當(dāng)模型動(dòng)物膝關(guān)節(jié)可見軟骨表面變白、粗糙、缺損，有明顯關(guān)節(jié)腔積液，證明兔KOA造模成功。

3.權(quán)利要求1所述的藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟二中的藥刮法具體做法為：按照人和動(dòng)物體表面積換算出動(dòng)物體表面積比率，確定所用動(dòng)物膝關(guān)節(jié)處所需鐵包金按摩膏的用量，間隔一天采用刮痧板涂抹鐵包金按摩膏，共計(jì)8-10次；采用刮痧板涂抹鐵包金按摩膏時(shí)，單手握持刮痧板，將板放置掌心，一側(cè)由拇指固定，另一側(cè)由食指和中指固定，遠(yuǎn)心端與皮膚呈45°沿下肢長(zhǎng)軸方向從上向下刮拭，移動(dòng)范圍在5cm以內(nèi)，力度以皮色不變，可有輕微發(fā)熱感而無(wú)皮膚破損為度，約為20-30N；刮痧頻率為20-40次/分鐘，操作時(shí)間平均8-10min，刮至皮膚微微發(fā)紅，不出丘疹點(diǎn)即可。

4.權(quán)利要求1所述的藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟三中的動(dòng)物標(biāo)本制作過程為：待對(duì)兔KOA藥刮法實(shí)驗(yàn)完成后，用1-3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)于兔耳緣靜脈處?kù)o推，成功麻醉后，從右后膝內(nèi)側(cè)入路進(jìn)入膝關(guān)節(jié)內(nèi)，快速地手術(shù)切取右后膝關(guān)節(jié)股骨髁及脛骨平臺(tái)部分關(guān)節(jié)軟骨，修成體積為0.5x0.4x0.2cm³的組織塊，標(biāo)本制作完成。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的藥刮法對(duì)兔KOA模型軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述步驟四中對(duì)標(biāo)本中的軟骨組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察過程包括：

(1)固定:將各組織塊置于2-4％多聚甲醛溶液中，常溫下固定2-3天；

(2)脫鈣:將標(biāo)本沖洗干凈后放置在10％EDTA脫鈣液中20-30天，存放在30-40℃恒溫箱中，每7天需更換2次脫鈣液(當(dāng)用毫針能夠輕松扎進(jìn)軟骨組織中時(shí)意味著可停止脫鈣，進(jìn)行下一步驟)；

(3)石蠟包埋：依次在75％，85％,95％和100％乙醇中梯度脫水，二甲苯透明，恒溫箱中浸蠟3-4次，使用包埋機(jī)包埋，自然冷卻后，-20℃凍過夜，取出倒置于冰上，切片機(jī)切片；

(4)60℃烤片1-2h；

(5)切片脫蠟/復(fù)水：首先用二甲苯浸泡各個(gè)切片8-10min，泡2次。再接著輪流放入100％，95％，85％和75％乙醇中，每梯度乙醇放置5min。最后用蒸餾水浸泡沖洗5-10min；

(6)蘇木素染5-10min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；

(7)伊紅染3-5min，蒸餾水沖洗；

(8)梯度酒精(75-100％)脫水，每級(jí)5-10min，或者直接把片子烤干，取出后將其浸泡于二甲苯中10min，2次，用中性樹膠進(jìn)行封片處理。

(9)在光學(xué)顯微鏡下觀察后拍照，圖片保存留底，依據(jù)改良Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)實(shí)行評(píng)分。