[發(fā)明專利]一種沙門菌菌蛻疫苗的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011478059.3
• 申請(qǐng)日: 2020-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN112587659A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬喆;左庚亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/112
• 分類號(hào): A61K39/112;A61K47/42;A61P31/04;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/42
• 代理公司: 上海創(chuàng)開專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31374
• 代理人: 吳海燕

本發(fā)明公開了一種沙門菌菌蛻疫苗的制備方法及應(yīng)用，利用λ?Red系統(tǒng)制備獲得雞白痢沙門菌pagC基因缺失突變株ΔPagC；取過夜培養(yǎng)的ΔPagC菌液，1:100接種到50ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至OD值約0.8；4℃，5000rpm離心10min后用無菌的PBS緩沖液洗滌3次，然后用終濃度為50μM的MAP溶液重懸菌體至OD值為0.3，21℃恒溫靜置16h，4℃、5000rpm離心10min收集菌體，進(jìn)行滅菌效果檢測(cè)和核酸殘留檢測(cè)；檢測(cè)合格后調(diào)整劑；與佐劑1:1混合，充分乳化后接種動(dòng)物。本發(fā)明疫苗株接種小鼠后無不良反應(yīng)，可保護(hù)小鼠應(yīng)對(duì)雞白痢沙門菌CVCC1800、腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542的感染；該疫苗能夠能與基于PagC蛋白的沙門菌抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)沙門菌人工免疫和自然感染的鑒別診斷，表現(xiàn)出良好的DIVA特性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸醫(yī)學(xué)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種沙門菌菌蛻疫苗的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

沙門菌病長(zhǎng)期困擾著各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)，是沙門菌屬的不同血清型感染動(dòng)物后引起的多種疾病的總稱。該病對(duì)幼畜和幼禽的危害最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為腸熱、急性敗血癥等致死性病癥，成年畜禽多呈慢性或隱性感染。患病和帶菌動(dòng)物是本病的主要傳染源，不僅在種群中持續(xù)排毒，也可以垂直傳播給下一代。疫苗是控制該病的有效手段，但是傳統(tǒng)滅活疫苗由于不良反應(yīng)明顯，引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力較弱等問題無法滿足市場(chǎng)的需求。而且根據(jù)臨床病癥對(duì)群體進(jìn)行陽(yáng)性凈化的方法無法及時(shí)淘汰隱性感染的群體，因此亟需開發(fā)一種免疫效果良好且具有DIVA(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals)特性的新型疫苗，通過與血清學(xué)檢測(cè)相配合來實(shí)現(xiàn)沙門菌的有效凈化。

細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一些能夠穿透細(xì)胞膜的小分子多肽，具有與抗微生物肽類似的功能。它們一般長(zhǎng)度不超過30個(gè)氨基酸。MAP就是其中的一種。該多肽最早合成于上世紀(jì)90年代，對(duì)G+巨大芽孢桿菌和G-大腸桿菌均表現(xiàn)出相同的抗菌作用。研究中利用細(xì)胞穿透肽MAP對(duì)鴨致病性大腸桿菌DE17進(jìn)行處理后，出現(xiàn)了特異性孔道。在保持細(xì)胞膜相對(duì)完整的前提下，利用滲透壓作用將胞內(nèi)物質(zhì)部分排出，形成菌蛻。菌蛻是革蘭氏陰性菌在被噬菌體PhiX174裂解基因E裂解后，膜內(nèi)容物大量流出形成的細(xì)菌空殼。內(nèi)容物的流失降低了菌蛻疫苗的不良反應(yīng)性。溫和的裂解方式使菌蛻膜組分得以完整保留，包括脂多糖、肽聚糖和鞭毛蛋白等天然的細(xì)菌組分。這些結(jié)構(gòu)使菌蛻具有成為佐劑的巨大潛力，因此受到研究人員的廣泛關(guān)注。

PagC蛋白是沙門菌屬內(nèi)高度保守的特異性蛋白，屬內(nèi)的同源性高達(dá)95％以上。編碼該蛋白的pagC基因廣泛分布于各類禽源和鼠源的沙門菌血清型中，是標(biāo)記疫苗理想的鑒別診斷靶點(diǎn)。

基于上述考慮，本發(fā)明人在前期實(shí)驗(yàn)室利用λ-Red同源重組法獲得的雞白痢沙門菌ΔPagC突變株基礎(chǔ)上，用人工合成的穿孔肽MAP研制了一種沙門菌菌蛻疫苗，并對(duì)其免疫效果和DIVA特性進(jìn)行了評(píng)估。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種沙門菌菌蛻疫苗的制備方法及應(yīng)用，所述疫苗株接種小鼠后無不良反應(yīng)，對(duì)雞白痢沙門菌CVCC1800、腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542均起到良好的保護(hù)效果，該疫苗能夠能夠與基于PagC蛋白的沙門菌抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)鑒別診斷，表現(xiàn)出良好的DIVA特性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種沙門菌菌蛻疫苗的制備方法，包括以下步驟：

步驟S1，利用λ-Red系統(tǒng)制備獲得雞白痢沙門菌基因缺失突變株ΔPagC；

步驟S2，缺失株LB平板劃線，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；

步驟S3，取過夜培養(yǎng)的雞白痢沙門菌ΔPagC菌液，1:100接種到50ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)至OD值約0.8；