[發明專利]一種雞早期胚胎提取方法及圖譜制作的方法

在審

• 申請號: 202011478015.0
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112626007A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 李輝;姜海煦;劉帥;宿志勇;冷麗;李玉茂;欒鵬
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;G01N21/84
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司 23101
• 代理人: 吳振剛

本發明提供一種雞早期胚胎提取方法及圖譜制作的方法，克服了因為雞蛋品質不同所造成蛋黃液影響早期胚胎提取較難的問題，方法是：在蛋殼尖端剪一個開口，隨后將胚胎內含物傾斜倒出至含有平衡鹽溶液的培養皿中，使用鑷子刺入胚盤外緣以固定蛋黃，隨后使用剪刀沿胚盤外緣切割，切割完成后，使用鑷子將卵黃膜及胚盤拉出切割下的卵黃區域，隨后使用鑷子將胚盤外層的卵黃膜和蛋白層分離，此時胚盤已經完整分離，利用鑷子將存有胚胎的完整胚盤拉置于載玻片上，隨后將載玻片取出。根據雞早期胚胎發育的不同時期的孵化時間將雞胚胎取出，制成圖譜。采用本方法提取的雞早期胚胎細胞、組織、器官活性較高。本發明具有提取成本低、效率高的優點。

技術領域

本發明涉及一種雞早期胚胎提取方法及圖譜制作的方法。

背景技術

雞是一種在體內受精，體外孵化的家禽。母雞受精后產下的受精卵需在體外適應的溫度，光照，濕度等條件才能由胚胎孵化為雞雛。雞早期胚胎的一系列正常階段分為46個時期(HH46)(A series of normal stages in the development of the chick embryo.JMorphol.1951Jan；88(1):49-92.)，其中孵化的前三天包括了20個HH分期，為雞早期胚胎發育的關鍵時期。制作發育圖譜，有利于人們了解雞胚胎發育各時期的生理特點，在生物醫學上具有一定的借鑒意義，胚胎的正常發育決定孵化率以及雞雛的健康程度，所以在農業畜牧生產中研究早期胚胎具有重要的意義。然而雞胚胎發育是在體外的蛋殼環境內完成的，且早期雞胚胎較小，胚胎發育區域有較多附著物，這為研究雞早期胚胎發育造成困難。此前，一項國外的研究(Improved method for chick whole-embryo culture using afilter paper carrier.Dev Dyn.2001Mar；220(3):284-9.)在瓊脂-白蛋白的培養皿上用三層濾紙將其剪成三葉草形狀并貼于蛋黃和蛋白上，再通過濾紙吸水性將早期胚胎取下，再進行處理。該技術能成功提取早期胚胎，具有一定成功率。濾紙環提取雞早期胚胎的方法操作繁瑣，對于濾紙厚度規格，提取人員的技術能力有一定要求；提取到的早期胚胎會附著卵黃顆粒蛋白等物質；在卵黃粘稠，卵黃膜透薄的情況下，容易造成提取失敗，無法分離胚胎細胞，組織和器官；制作圖譜時成像清晰度略差。近期的一項專利表明(發明創造名稱：一種雞胚胎提取物的制作方法，中國公開號N106138101B,2019-09-17)通過種蛋去殼后將雞胚胎干燥，粉碎來提取雞胚胎提取物，該方法能提取到雞胚胎較全的胚胎發育物，但是對于雞早期胚胎的細胞、組織和器官的分離明顯不適用。探索，尋找一種簡單，高效，準確的提取雞早期胚胎的方法顯得尤為重要。

發明內容

基于以上不足之處，本發明提供一種雞早期胚胎提取的方法，克服了因為雞蛋品質不同所造成蛋黃液影響早期胚胎提取較難的問題。

本發明的目的是這樣實現的：一種雞早期胚胎提取的方法，如下：在蛋殼尖端剪一個開口，隨后將胚胎內含物傾斜倒出至培養皿中，所述的培養皿中盛有溫度為2-4℃平衡鹽溶液；將雞胚盤調整位置置于液面，持續冰浴，使用鑷子刺入胚盤外緣以固定蛋黃，隨后使用剪刀沿胚盤外緣切割，切割完成后，使用鑷子將卵黃膜及胚盤拉出切割下的卵黃區域，隨后使用鑷子將胚盤外層的卵黃膜和蛋白層分離，此時胚盤已經完整分離，利用鑷子將存有胚胎的完整胚盤拉置于載玻片上，隨后將載玻片取出；所述的平衡鹽溶液的制作方法：稱取1.000g NaCl試劑至容器中，加DDH₂O溶解定容至100ml，分別稱取1.165g Na₂HPO₄，0.165gKH₂PO₄，0.01g CaCL₂，倒入容器中溶解，調節pH值到7.2，調滲透壓至285MOSM,最后細胞濾器過濾分裝，放至2-4℃保存使用。

本方法還具有如下技術特征：將種蛋內容物倒入盛有平衡鹽溶液的培養皿中，所述的平衡鹽溶液液面剛好淹沒蛋黃。