[發(fā)明專利]一種半夏提取物的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011476033.5
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112451603A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周春陽;楊春艷;林勇;周上生;樊孔明;朱麗華
• 申請（專利權(quán)）人: 川北醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: A61K36/8888
• 分類號: A61K36/8888;A61P1/16;G01N31/16;C12Q1/02
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 朱學(xué)繪

1.一種半夏提取物的制備方法，其特征在于：包括以下制備方法：以體積分?jǐn)?shù)55％的乙醇作為提取溶劑，固定料液比為1:50，在溫度為60℃的水浴條件下進(jìn)行超聲輔助提取40min，功率100W，頻率40kHz。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種半夏提取物的制備方法，其特征在于：還包括具體制備步驟為：所述測量方法包括供試品溶液的制備、對照品溶液的制備、供試品溶液的測定；所述供試品溶液的制備方法步驟為：

(1)將已經(jīng)超聲提取好的供試品溶液過濾，蒸干，殘?jiān)芗尤?.1mol/L氫氧化鈉滴定液10ml，超聲溶解功率100W，頻率40kHz，時間30min，將已經(jīng)超聲溶解的樣品轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中；

(2)然后加入新煮沸過的冷水至刻度線，搖勻得供試品溶液；

所述對照品溶液的制備方法步驟為：精密稱取對照品琥珀酸100mg，將其置于50ml的容量瓶中，加入55％的乙醇定容至刻度線，得到對照品溶液儲備液；

所述供試品溶液的測定方法步驟為：

(1)用25ml移液管精密移取25ml供試品溶液至50ml的小燒杯中；

(2)根據(jù)電位返滴定法，用0.1mol/L鹽酸滴定液進(jìn)行滴定，記錄鹽酸滴定液消耗的體積；

(3)以相鄰兩次的ΔpH/Δv與相鄰兩次鹽酸滴定液的的平均值之比為縱坐標(biāo)，以相鄰兩次鹽酸滴定液的的平均值為橫坐標(biāo)即繪制曲線，即當(dāng)ΔpH²/Δv²為零時即為滴定終點(diǎn)，記錄此時的消耗的鹽酸滴定液的體積V；

每1ml的0.1mol/l氫氧化鈉滴定液相當(dāng)于琥珀酸C4H6O4的5.904mg，所述樣品總有機(jī)酸的百分含量計(jì)算公式為：所述V空白為空白消耗的鹽酸滴定液的體積ml；所述V為樣品消耗鹽酸滴定液的體積ml；所述CHcl為鹽酸滴定液的濃度；所述W為稱取的半夏的質(zhì)量g。

3.一種半夏提取物的應(yīng)用，其特征在于：采用FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立體外非酒精性脂肪肝NAFLD模型在體外抗NAFLD活性中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種半夏提取物的應(yīng)用，其特征在于：還包括具體應(yīng)用為：

(1)將處于指數(shù)期的細(xì)胞以4000/孔的密度100μL接種到96孔板中，24小時后，棄培養(yǎng)液，并添加以下不同濃度的藥物100μL；

(2)半夏提取物濃度為100，150，200，250，300μg/mL，使用10％FBS-DMEM-h稀釋母液配制而成；加入貼壁細(xì)胞，每個濃度3復(fù)孔，重復(fù)2次；其中對于未處理的細(xì)胞進(jìn)行對照，加入完全培養(yǎng)基；

(3)將細(xì)胞放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中，分別再培養(yǎng)12、24、48h；

(4)每孔加入10μLCCK－8溶液；培養(yǎng)1.5小時后，使用酶標(biāo)儀,在450nm處進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定以檢測光密度OD；

(5)將處于指數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞2mL接種在6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60％左右，吸出培養(yǎng)液，PBS清洗2次；

(6)使用濃度為1mM FFA作用24h誘導(dǎo)高脂模型，根據(jù)下述分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入總體積為2mL，建模的同時加藥處理，24h后分別進(jìn)行油紅O染色，測定細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種半夏提取物的應(yīng)用，其特征在于：所述TG、TC測定步驟為：

(1)細(xì)胞樣本的前處理：用胰酶將細(xì)胞消化下來，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀；

(2)細(xì)胞沉淀的洗滌：在細(xì)胞沉淀中加入1mL的PBS，輕輕混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀；

重復(fù)上述操作反復(fù)洗滌1～2次。

勻漿的方式：

在細(xì)胞沉淀中加入100μL的細(xì)胞裂解液，混勻，冰上裂解15min，低溫4℃，12000rmp離心15min，取上清10μl進(jìn)行總蛋白的測定，總蛋白含量按照試劑盒操作；然后將剩下的破碎細(xì)胞懸液70℃水浴10min，然后3000rmp離心5min，取上清按照試劑盒操作測定TG、TC含量；

濃度計(jì)算方式：

分別繪制TG、TC和蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

TG：2.26mmol/L，TC：5.17mmol/L，蛋白：52.4g/L：0，0.5，1，2.5，5，10μl，總體積10μL，其余體積用蒸餾水補(bǔ)充+250μL工作液，

樣品結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算；

在作用時間為12-48h內(nèi)，半夏提取物濃度150-250μg/mL處理下，細(xì)胞的存活率基本可以達(dá)到90％以上，且通過記錄12-48h內(nèi)不同濃度下細(xì)胞的狀態(tài)，基本符合cck8結(jié)果，故分別選擇用250、200、150μg/mL、高、中、低3種濃度的半夏提取物對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響進(jìn)行了研究。