[發(fā)明專(zhuān)利]雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株亞單位疫苗、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011473614.3
• 申請(qǐng)日: 2020-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112500458B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祁小樂(lè);王笑梅;高玉龍;高立;李凱;崔紅玉;劉長(zhǎng)軍;潘青;張艷萍;劉愛(ài)晶
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心哈爾濱分中心）
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/08;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/70;C12N15/40
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.一種雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）新型變異株亞單位疫苗在制備防治雞傳染性法氏囊病病毒藥物中的用途，其特征在于，所述的疫苗中含有經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白組成的病毒樣顆粒，所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的雞傳染性法氏囊病病毒為IBDV超強(qiáng)毒株；

所述的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白組成的病毒樣顆粒是將編碼所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的核苷酸序列插入表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化后獲得。

2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，編碼所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的表達(dá)載體為pCold I表達(dá)載體。

4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的大腸桿菌為E. coli Transetta(DE3)表達(dá)工程菌。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的亞單位疫苗通過(guò)以下步驟制備：

（1）合成得到編碼權(quán)利要求1中所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的核苷酸序列，并在所述的核苷酸序列的兩端加上限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，得到目的片段；

（2）利用同源重組試劑盒將步驟（1）得到的目的片段與經(jīng)相同酶切位點(diǎn)線性化后的pCold I表達(dá)載體進(jìn)行同源重組反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取同源重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，轉(zhuǎn)化后12小時(shí)挑取單克隆，運(yùn)用菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，將經(jīng)鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pCo-HHT28-SHG19VP2-466；

（3）將pCo-HHT28-SHG19VP2-466轉(zhuǎn)化入 E. coli Transetta (DE3)表達(dá)工程菌中，轉(zhuǎn)化后12小時(shí)挑取單克隆菌落接種至氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲菌液，進(jìn)行RT-PCR鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性菌即為大腸桿菌基因工程菌Transetta (DE3)-SHG19VP2株菌種，于負(fù)80℃保存；

（4）重組蛋白的表達(dá)

將大腸桿菌基因工程菌Transetta (DE3)-SHG19VP2株菌種接種氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6時(shí)，將搖瓶從搖床中取出，置冰上快速冷卻，在搖瓶中加入IPTG，繼續(xù)在搖床上培養(yǎng)；

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)入離心管，離心，棄去培養(yǎng)基，用PB緩沖液充分重懸菌體沉淀，隨后將菌體運(yùn)用高壓細(xì)胞破碎儀進(jìn)行高壓破碎，將破碎后的菌液離心，棄沉淀，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的溶液；

（5）重組蛋白的純化

將得到的含有雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的溶液經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀法獲得初步純化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白，然后再通過(guò)分子篩法進(jìn)一步獲得純化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白，負(fù)染電鏡結(jié)果顯示，純化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白形成了病毒樣顆粒；

疫苗的制備

將步驟（5）得到的病毒樣顆粒以1:2的體積比與白油佐劑混合后充分乳化，得到傳染性法氏囊病病毒新型變異株亞單位疫苗。

6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，在編碼權(quán)利要求1中所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的核苷酸序列的兩端分別加上KpnI和EcoRI酶切位點(diǎn)。

7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，編碼權(quán)利要求1中所述的經(jīng)優(yōu)化后的雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。