[發(fā)明專(zhuān)利]LAMP引物組包含其的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用和檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011470055.0
• 申請(qǐng)日: 2020-12-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112442548A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖艷松;曹志輝;李武進(jìn);朱俊子;鐘杰;鐘權(quán);何斌;余金龍;吳文信;李思軍;李生;范光獎(jiǎng);龍武石
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南省煙草公司郴州市公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 劉桐亞

本發(fā)明提供了一種LAMP引物組包含其的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用和檢測(cè)方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述LAMP引物組包括上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，其中上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.1～4所示。上述4條引物是由煙草靶斑病菌AG3融合群的ITS序列作為靶標(biāo)分子而設(shè)計(jì)得到的。因此，上述4條引物對(duì)煙草靶斑病具有較高的特異性和敏感性，進(jìn)而包括該LAMP引物組的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)煙草靶斑病的快速檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種LAMP引物組包含其的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

煙草靶斑病由瓜亡革菌擔(dān)孢子引起的一種重要的煙草葉部病害，其無(wú)性態(tài)為立枯絲核菌。病害早期容易與其它葉部病害如煙草赤星病等混淆，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦流行便發(fā)展迅速，防止困難，造成重大損失。因此，建立一種煙草靶斑病快速檢測(cè)方法對(duì)該病害早期防控非常重要。

目前對(duì)該病害的檢測(cè)方法主要包括，病原菌分離和鑒定，以及普通的 PCR和熒光定量PCR鑒定。這些方法要么對(duì)專(zhuān)業(yè)要求比較高，且過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，要么對(duì)儀器設(shè)備要求高，不能達(dá)到高效經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)要求。

因此，急需研究開(kāi)發(fā)出一種敏感性強(qiáng)、特異性高、檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)設(shè)備要求低的煙草靶斑病檢測(cè)方法，以避免在該病害早期與其它葉部病害如煙草赤星病等混淆問(wèn)題，變得十分必要和緊迫。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種LAMP引物組以及包含該LAMP引物組的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒和檢測(cè)方法，上述引物組是由煙草靶斑病菌的ITS序列及其它絲核菌不同融合群序列作為靶標(biāo)分子而設(shè)計(jì)的，因此，上述LAMP引物組對(duì)煙草靶斑病具有較高的特異性和敏感性，進(jìn)而包括該 LAMP引物組的用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)煙草靶斑病的快速檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明特提出如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的一種LAMP引物組，所述LAMP引物組包括上游內(nèi)引物 FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，其中：

所述上游內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述上游外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述下游外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明提供的上述LAMP引物組在煙草靶斑病檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種用于煙草靶斑病檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括含有上述LAMP引物組的引物溶液。

進(jìn)一步的，所述引物溶液中上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3的摩爾比為1～2μM：1～2μM：0.1～0.4μM： 0.1～0.4μM：0.2～0.5μM：0.2～0.5μM。

進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括LAMP反應(yīng)緩沖液、dNTPs、Mg²⁺、鏈置換DNA聚合酶以及與dsDNA具有結(jié)合能力的熒光染料中的任意一種或至少二種的組合。

進(jìn)一步的，所述試劑盒的反應(yīng)體系包括：

引物溶液、LAMP反應(yīng)緩沖液、dNTPs、MgSO₄、鏈置換DNA聚合酶、 dsDNA具有結(jié)合能力的熒光染料和超純水；