[發明專利]一種利用側孢短芽孢桿菌生產抗菌肽的生產工藝

有效

• 申請號: 202011468387.5
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112553276B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 郄麗萍;張雪霞;胡衛國;任風芝;陳博;李麗紅;安泰;楊鑫;馬婕;段銀簫;葛鹍鵬;朱京童
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司;中糧營養健康研究院有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種以側孢短芽孢桿菌為菌種生產抗菌肽的發酵工藝。本工藝改進了發酵有機氮源組合，并動態調控發酵過程：發酵10?20hr流加有機氮源，控制溶氧，調控發酵PH；控制發酵后期的泡沫；培養12?25hr，得到具有抗細菌及真菌的活性的多組分抗菌肽，發酵產量達到3500ug/ml以上。與優化前相比，抗菌肽的產量提高3倍，成本大幅降低。

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，具體地涉及側孢短芽孢桿菌生產多組分抗菌肽的發酵工藝。

背景技術

抗菌肽，又被稱為抗微生物肽和肽抗生素，來源于多種生物，是自然界生物體內天然防衛系統的組成部分。抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽，這類活性多肽多數具有堿性，熱穩定性，耐受PH范圍廣的優點以及廣譜抗菌的特點。不僅用于革蘭氏陰性菌，而且也作用于真菌，昆蟲和某些病毒和腫瘤。與抗生素相比，對人和動物正常細胞無傷害，無副作用，無殘留。與傳統抗生素有無法比擬的優越性，不會誘導抗藥菌株產生，在國家發布限抗令后，有希望成為新一代抗菌劑，是替代抗生素的最佳選擇。

芽孢桿菌屬(Bacillus)其在食品工業中具有安全的應用歷史，尤其是側短芽孢桿菌，其產生的抗菌肽有抑制多種細菌和真菌的功能，并且具有安全性高，抗菌譜廣，穩定性好，無殘留的特點，是一種潛在的益生菌。成為近年的研究熱點，已被廣泛用于食品及食品防腐保鮮；在飼料工業中，已經被農業部批準可用于飼料微生態制劑，應用于肉雞，肉鴨，豬和蝦的養殖，具有極高的安全性；用于作物病害防治領域，形成綠色無抗農業生產。

目前抗菌肽發酵生產工業化過程中存在很多問題，如菌種產量低，成本高，抗菌肽與培養基不易分離，發酵過程產生的氣泡使發酵過程不易控制等問題。因此發酵法生產抗菌肽的每個過程都制約著抗菌肽的產量和質量，例如側短芽孢桿菌是細菌，其產物生產期短，制約著抗菌肽的產量。CN 104004803通過在發酵生產后期添加活性炭吸附抗菌肽產物，解除產物反饋抑制的角度，增加抗菌肽的產量。CN 105255973利用磁場促進解淀粉芽孢桿菌高產抗菌肽。提高發酵生產抗菌肽的產量和質量，需要更適合工業化的方法。

發明內容

針對目前抗菌肽生產發酵工藝中的產量低、過程不易控制等問題，本發明通過改進發酵配方和調控發酵過程，提供了一種延長細菌發酵生產周期并提高發酵產量的側短芽孢桿菌抗菌肽發酵工藝。

本發明要解決的技術問題通過以下技術方案予以實現：

本發明提供一種發酵生產抗菌肽的發酵工藝：以側孢短芽孢桿菌(Brevibaclluslaterosporus)為菌種，接入含碳源、無機、有機氮源、及無機鹽組成的種子及發酵培養基中，發酵制備獲得抗菌肽，其包括步驟：

1)斜面菌種活化：側孢短芽孢桿菌冷藏管菌種接種在LB斜面培養基中培養；

2)種子搖瓶培養：將斜面培養物接入滅菌的種子培養基中搖瓶培養得到種子液；

3)種子罐培養：將一級種子罐中種子培養基滅菌后，接種步驟2)得到的種子液，培養得到種子液；

4)發酵培養：將步驟2)或3)得到的種子液，接種到發酵培養基中，溶氧控制在20％以上；在發酵10-20小時期間，每升發酵液補入FP101胰蛋白胨0.2-2g，PH在6.0-6.5，在泡沫高發期控制泡沫，總發酵培養周期為12-25hr，獲得抗菌肽。

所述側短芽孢桿菌為側孢芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)CGMCCNo.16337。

進一步優選方案：

斜面菌種活化：側孢短芽孢桿菌冷藏管菌種接種在LB斜面培養基中，32-38度培養3天。