[發(fā)明專利]單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)快速同步多重檢測(cè)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011465379.5
• 申請(qǐng)日: 2020-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112575054B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 隋志偉;劉思淵;王梓權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/06
• 分類號(hào): C12Q1/06;C12R1/01
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.一種非診斷目的的快速同步多重檢測(cè)樣品中單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的方法，其特征如下：

1）區(qū)分樣品中的細(xì)菌和其它背景顆粒：使用可以標(biāo)記全部細(xì)菌的紅色熒光探針對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行標(biāo)記；

2）區(qū)分樣品中的單增李斯特菌和非單增李斯特菌：使用綠色熒光探針通過(guò)化學(xué)基團(tuán)交聯(lián)的單增李斯特菌抗體，特異性標(biāo)記樣品中的單增李斯特菌；

3）通過(guò)流式分析儀同時(shí)計(jì)數(shù)1）和2）產(chǎn)生的紅色和綠色熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的同步定量檢測(cè)；

上述2）中，制備所述抗體的免疫原，為4個(gè)血清型單增李斯特菌菌株的特異性膜蛋白的混合物，所述4個(gè)血清型分別為1/2a、1/2b、1/2c和4b；且，將制備得到的抗體進(jìn)行篩選，選出符合以下 a-d技術(shù)指標(biāo)的抗體，即為可同步檢測(cè)單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的抗體:

a 所述抗體可以在流動(dòng)相內(nèi)與單增李斯特菌發(fā)生反應(yīng)；

b 所述抗體經(jīng)過(guò)綠色熒光探針交聯(lián)后，能夠?qū)卧隼钏固鼐M(jìn)行熒光標(biāo)記，且熒光可以被熒光顯微鏡和流式分析儀觀察到；

c 所述抗體與單增李斯特菌特異性菌體蛋白的親和力KD應(yīng)小于1 ×10-9；

d 所述抗體能夠識(shí)別血清型為1/2a、1/2b、1/2c和4b的單增李斯特菌菌株;

上述3）中，單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的判定方法如下：對(duì)于一個(gè)顆粒產(chǎn)生的事件，如果僅檢測(cè)到紅色熒光，則判定為細(xì)菌，但不是單增李斯特菌；如果同時(shí)檢測(cè)到紅色和綠色兩種熒光，則判定為單增李斯特菌；如果未檢測(cè)到熒光，則判定為非細(xì)菌的雜質(zhì)顆粒。

2.權(quán)利要求1所述的方法，所述通過(guò)流式分析儀計(jì)數(shù)，是通過(guò)流式分析儀的散射光通道進(jìn)行圈門，權(quán)利要求1并通過(guò)雙熒光通道檢測(cè)所述紅色和綠色熒光信號(hào)，從而計(jì)數(shù)單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)；其中，前向角散射光通道的圈門在500 nm到2500 nm之間。

3.權(quán)利要求2所述的方法，所述圈門，其方法為：使用流式分析儀測(cè)量500 nm標(biāo)準(zhǔn)微球和2500 nm標(biāo)準(zhǔn)微球，在前向角散射光通道的直方圖上，根據(jù)微球的信號(hào)位置進(jìn)行圈門，下限在500 nm，上限在2500 nm。

4.權(quán)利要求1所述的方法，所述紅色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在 601 nm～640 nm；所述綠色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在 501 nm～540 nm。

5.權(quán)利要求1所述的方法，所述流式分析儀的技術(shù)指標(biāo)和檢測(cè)參數(shù)是：熒光靈敏度10MESF，散射光靈敏度50 nm，熒光分辨率RSD 3%，散射光分辨率 3 %；分析速度為1～30μL/min，檢測(cè)時(shí)間為 15～300 s。

6.權(quán)利要求1~5任一所述的方法，待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)之前需要進(jìn)行純化處理；所述純化，方法是將待測(cè)樣品加入水中懸液，然后過(guò)濾收集濾液，將濾液離心并棄去上層液體，保留底部的沉淀，然后加入PBS重懸，得到純化的樣品菌懸液。

7.一種用于快速同步多重檢測(cè)樣品中單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的單增李斯特菌抗體，技術(shù)指標(biāo)如下：

a 制備所述抗體所用免疫原為4個(gè)血清型單增李斯特菌菌株的特異性膜蛋白的混合物，所述4個(gè)血清型分別為1/2a、1/2b、1/2c和4b；

b 所述抗體可以在流動(dòng)相內(nèi)與單增李斯特菌發(fā)生反應(yīng)；

c 所述抗體經(jīng)過(guò)綠色熒光探針交聯(lián)后，能夠?qū)卧隼钏固鼐M(jìn)行熒光標(biāo)記，且熒光可以被熒光顯微鏡和流式分析儀觀察到；

d 所述抗體與單增李斯特菌特異性菌體蛋白的親和力KD應(yīng)小于1 ×10-9；

e 所述抗體能夠識(shí)別血清型為1/2a、1/2b、1/2c和4b的單增李斯特菌菌株。

8.一種快速同步多重檢測(cè)樣品中單增李斯特菌和細(xì)菌總數(shù)的試劑盒，其特征是具有：

可以標(biāo)記樣品中全部細(xì)菌的紅色熒光探針；

綠色熒光探針通過(guò)化學(xué)基團(tuán)交聯(lián)的特異性單增李斯特菌抗體；

500 nm和2500 nm的校準(zhǔn)微球；

所述單增李斯特菌抗體如權(quán)利要求7所述。

9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，還含有孔徑2.5 μm～15 μm的濾膜；且所述紅色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在 601 nm～640 nm；所述綠色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在 501 nm～540nm。