[發(fā)明專(zhuān)利]太白貝母的Indel標(biāo)記引物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011465322.5
• 申請(qǐng)日: 2020-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112359135B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖海;周嘉裕;張?zhí)?/a>;王威威;蔣瑞平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西南交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都信博專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽(yáng)

本發(fā)明提供一種快速鑒定太白貝母的Indel標(biāo)記引物、方法及用途，屬中藥材來(lái)源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)以該Indel標(biāo)記引物為核心的PCR方法能夠特異性鑒定太白貝母，僅有太白貝母在302bp位置顯示陽(yáng)性結(jié)果，其它貝母品種顯示為陰性結(jié)果。可用于太白貝母基原植物與藥材的特異性分子鑒定。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：①特異性好，僅有太白貝母在302bp位置顯示出陽(yáng)性結(jié)果；②靈敏度高，PCR的最低檢測(cè)濃度(DNA)為0.239ng/μL；③步驟少、檢測(cè)周期短：操作時(shí)間僅需2?3小時(shí)；④重現(xiàn)性好：已經(jīng)進(jìn)行了10次以上的生物學(xué)重復(fù)，重現(xiàn)性達(dá)到100％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于中藥材來(lái)源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種太白貝母的InDel標(biāo)記引物及利用該標(biāo)記引物建立的PCR方法，能夠準(zhǔn)確區(qū)分太白貝母與其它基原貝母品 種，有效保證藥材基原的準(zhǔn)確性與質(zhì)量安全。

技術(shù)背景

以植物、動(dòng)物來(lái)源的中藥材在生物學(xué)上物種的確定，稱(chēng)之為基原。如果中藥材 標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源項(xiàng)下收載有兩個(gè)及以上基原的情況稱(chēng)之為多基原中藥材。盡管多基原緩解 了中藥材的市場(chǎng)空缺，然而多基原的混合使用嚴(yán)重影響中藥臨床療效的有效性、安 全性與質(zhì)量可控性。為此，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局于2016年頒布《中藥配方顆 粒管理辦法(征求意見(jiàn)稿)》規(guī)定：“對(duì)栽培、養(yǎng)殖或野生采集的藥用動(dòng)植物，應(yīng)準(zhǔn) 確鑒定其物種，包括亞種、變種或品種，不同種的中藥材不可相互混用”。

貝母是典型的多基原藥材，極易混淆與摻雜。《中國(guó)植物志》中收載，太白貝 母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)為百合科(Liliaceae)貝母屬Fritillaria L.植 物，主要分布于陜西(秦嶺及其以南地區(qū))、甘肅(東南部)、四川(東北部)和 湖北(西北部)，生于海拔1100-3150米的山坡草叢中或水邊。2020年版《中國(guó)藥 典》收載川貝母、伊貝母、浙貝母、平貝母與湖北貝母等藥材品種。太白貝母屬于 川貝母藥材的6種基原之一，其余川貝母藥材的基原還包括卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa)、暗紫貝母(F.unibracteataP.K.HsiaoK.C.Hsia)、甘肅貝母(F. przewalskii)、梭砂貝母(F.delavayi)和瓦布貝母(F.unibracteata Hsiaoet K.C. Hsia var.wabuensis)。目前，2020版《中國(guó)藥典》中“川貝母”項(xiàng)下以有PCR- RFLP分子鑒定方法，該方法優(yōu)點(diǎn)是能夠區(qū)分川貝母與伊貝母等其余5種貝母藥 材，但缺點(diǎn)是不能區(qū)分川貝母的6種基原，并且也不能區(qū)分川貝母與濃蜜貝母、中華貝母和康定貝母等川貝母近緣物種。以致市場(chǎng)上出現(xiàn)了不同基原貝母、不同基原 川貝母、川貝母與一些近緣混淆品混用的現(xiàn)象。以上情況，均會(huì)嚴(yán)重影響臨床療效 與安全性，極大地危害消費(fèi)者及病患者利益，因此急需建立適合于單基原的準(zhǔn)確、 高效鑒定方法。公開(kāi)號(hào)為CN 201410064966的專(zhuān)利，使用葉綠體基因組測(cè)序方法用 于鑒定太白貝母，但該方法存在測(cè)序周期長(zhǎng)，成本高、樣本必需新鮮等缺點(diǎn)。基于 此目的，本發(fā)明建立一種能夠準(zhǔn)確鑒定太白貝母的分子生物學(xué)方法，能夠有效區(qū)分 太白貝母與非太白貝母(包括其余5種川貝母基原、非川貝母及一些川貝母近緣易 混種)。

太白貝母的鑒定主要依賴(lài)于傳統(tǒng)的性狀鑒定方法，此法主要從樣品的鱗莖色 澤、臍點(diǎn)形狀、鱗葉數(shù)量、抱合緊密度、頂端開(kāi)合、長(zhǎng)短以及氣味等特征進(jìn)行觀察 比較，需要豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，且栽培品形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)性較差。再加上人為干預(yù)栽培導(dǎo)致 不同貝母的相似度不斷上升，鑒別難度不斷增加，一般需要結(jié)合其他分析鑒定技術(shù) 進(jìn)行鑒別。化學(xué)方法如高效液相色譜以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，耗費(fèi)材料多，且需要大型 儀器支持，推廣難度大，因此，開(kāi)發(fā)更加便捷、快速的檢測(cè)方法以滿足藥材市場(chǎng)監(jiān) 控需求是刻不容緩的。

發(fā)明內(nèi)容