[發明專利]阪崎腸桿菌和細菌總數快速同步多重檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011464870.6
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112577884A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 隋志偉;劉思淵;王梓權
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

一種快速同步多重檢測樣品中阪崎腸桿菌和細菌總數的方法和檢測試劑盒，使用可以標記全部細菌的紅色熒光探針對細菌總數進行標記，區分樣品中的細菌和其它背景顆粒：同時，使用綠色熒光探針通過化學基團交聯的阪崎腸桿菌抗體，區分樣品中的阪崎腸桿菌和非阪崎腸桿菌；通過流式分析儀同時計數紅色和綠色熒光信號，實現阪崎腸桿菌和細菌總數的同步檢測。本方法能夠同時檢測阪崎腸桿菌和細菌總數，操作簡單便捷，耗時短，大多數樣品均可在0.5h內完成檢測。

技術領域：

本發明屬于食品微生物檢測領域，特別涉及在食品樣品中阪崎腸桿菌和細菌總數兩項指標的快速同步多重檢測及試劑盒。

背景技術：

阪崎腸桿菌是一類革蘭氏陰性腸桿菌，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，死亡率高達50％以上。菌落總數通常指細菌總數，用來判定食品被細菌污染的程度及衛生質量，其在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣。菌落總數和阪崎腸桿菌指標是食品微生物檢驗中最基本、最常見的檢測項目。

傳統的培養法對阪崎腸桿菌的測量方法費時費力，如國標GB 4789.40-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗》，該方法需要預增菌、增菌、培養、生化鑒定等一系列步驟，花費時間在72小時以上。

細菌總數的平板計數法也有很多缺點，如國標GB 4789.2-2016《菌落總數測定》，該方法需要采樣，稀釋，傾注平板，培養等一系列步驟，花費時間48小時。

這兩個方法都需要大量人工操作，費時費力，且沙門氏菌和細菌總數兩項指標的檢測還必須分別進行。

盡管目前有許多新的技術被用于阪崎腸桿菌或細菌總數的快速檢測，但是這些技術難以用于同阪崎腸桿菌和細菌總數的多重檢測。比如現有生物芯片法無法識別全部種類的細菌；PCR方法僅能實現不同種類細菌的多重檢測，無法實現細菌總數的檢測。

流式分析技術有實現阪崎腸桿菌和細菌總數指標的多重檢測的潛力，但是由于阪崎腸桿菌特異性熒光探針的開發存在許多技術困難，目前尚未有相關報道。

綜上所述，快速檢測，同步多重檢測，且能同時檢測阪崎腸桿菌和細菌總數，是食品微生物檢驗領域的實際需要，也是技術難點。

發明內容：

本發明的第一目的是提供一種阪崎腸桿菌和細菌總數的快速同步多重檢測方法，尤其是要滿足以下要求：1、必須能夠區分細菌和雜質；2、能夠定量測量細菌總數；3、可以從總細菌中特異性識別并定量阪崎腸桿菌；4、快速同步得到檢測結果。

本發明的第二目的是提供能達到上述目的的檢測試劑盒。

本方法具有兩個技術關鍵點：一是如何準確區分細菌和非細菌的顆粒；二是如何特異地識別阪崎腸桿菌。

針對上述問題，本發明人進行了如下工作：

1、開發能識別總細菌的熒光探針

由于細菌種類繁多，選用大腸桿菌、阪崎腸桿菌作為革蘭氏陰性菌的代表菌株，用金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的代表菌株，用枯草芽孢桿菌作為芽孢形態細菌的代表菌株。擬通過對四個代表性菌株的研究，并對能夠識別總細菌的熒光探針進行了開發和優化。

2、制備出適合的阪崎腸桿菌的特異性抗體

采用了偶聯有綠色熒光探針的阪崎腸桿菌的抗體，對阪崎腸桿菌進行特異性熒光標記，并使用流式分析儀對阪崎腸桿菌的熒光進行分析。

適用于流式分析儀的阪崎腸桿菌抗體的篩選十分困難：

第一，阪崎腸桿菌具有不同的血清型和O抗原，包括O1、O2、O3、O4、O5、O6和O7抗原，每個O抗原分類又包含多個阪崎腸桿菌種。這樣，能夠特異性識別所有阪崎腸桿菌的抗體很難研制。