[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)座因子載體及獲得其無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因后代的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011464276.7
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112481295A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 瞿紹洪;李莘;潘龍玉;畢冬玲;李利華;田旭丹;王嵐嵐;龍文莉;許趙蒙;劉中來;趙建華;鄒小維;高曉慶;楊海河;曲海艷
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;G01N21/64
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 陳繼亮

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)座因子載體及獲得其無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因后代的方法，該載體通過以下步驟構(gòu)建：1)將綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(mCherry)潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因(HPT)、來源于玉米的Ac轉(zhuǎn)座酶基因(AcTPase)和Ds轉(zhuǎn)座因子串聯(lián)組裝在一起，構(gòu)建轉(zhuǎn)座因子載體pBDL11，其中Ds因子不帶有任何選擇標(biāo)記，并且預(yù)先在其內(nèi)部設(shè)計一個AscI單酶切位點(diǎn)；2)構(gòu)建一個在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)均含有AscI酶切位點(diǎn)的中間載體pBDL11，以組裝任意目的基因，然后將目的基因切下并克隆到Ds因子內(nèi)部。本發(fā)明把基于GFP、mCherry雙熒光標(biāo)記的負(fù)選擇技術(shù)與基于PCR的正選擇技術(shù)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)基因后代依次淘汰含有T?DNA的個體和選擇含有目的基因的無選擇標(biāo)記個體，從而提高轉(zhuǎn)基因后代的篩選效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域，主要是一種轉(zhuǎn)座因子載體及獲得其無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因后代的方法。

背景技術(shù)

DNA載體應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域時，通常會包含一個能表現(xiàn)抗生素抗性或除草劑抗性的選擇標(biāo)記基因，在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然而，標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)長期保留，可能會對人類健康安全和周遭環(huán)境造成潛在的危害，當(dāng)植物轉(zhuǎn)化完成后，需要剔除選擇性標(biāo)記基因。創(chuàng)制無選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株可避免這些風(fēng)險并促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化種植。因此，近年來，建立高效而可靠的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)，已成為轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用的研究熱點(diǎn)。

基于玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因重整合方法，把目的基因置于Ds因子內(nèi)部，通過T-DNA轉(zhuǎn)化把攜帶目的基因的Ds因子、Ac轉(zhuǎn)座酶基因以及轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記等導(dǎo)入植物基因組。在Ac轉(zhuǎn)座酶作用下，Ds從T-DNA整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)座到另一位點(diǎn)，然后通過遺傳重組和遺傳分離，產(chǎn)生無T-DNA和穩(wěn)定遺傳的Ds個體，從而獲得無選擇標(biāo)記目的基因植株。轉(zhuǎn)座子技術(shù)相對于其他無選擇標(biāo)記系統(tǒng)具有兩個主要的優(yōu)點(diǎn)：第一，通過Ds轉(zhuǎn)座，只需要獲得少數(shù)初始轉(zhuǎn)化植株，就可以在分離世代通過繁殖獲得目的基因獨(dú)立整合的后代群體，以便篩選合適的轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)，避免轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平受“位置”效應(yīng)的影響。第二，帶有目的基因的轉(zhuǎn)座因子，在植物基因組中穩(wěn)定轉(zhuǎn)座后，其插入邊界清楚、轉(zhuǎn)基因DNA結(jié)構(gòu)變異的頻率較低，有利于目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。

最初，Goldsbrough設(shè)計的T-DNA轉(zhuǎn)化載體含有NptII選擇標(biāo)記基因、無轉(zhuǎn)座功能的順式Ac轉(zhuǎn)座酶基因以及嵌合在Ds元件中的GUS報告基因。在轉(zhuǎn)化番茄之后，Ds/GUS元件轉(zhuǎn)座到非連鎖的位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)化體自交之后與NptII發(fā)生分離，從而產(chǎn)生了去除NptII或者Ds/GUS的轉(zhuǎn)基因后代。然而，穩(wěn)定的Ds插入系的鑒定常常依賴于對大量的轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行Southern blot印記雜交分析，這種方法費(fèi)力且效率低。

在Gao等(2015)建立的單熒光蛋白遺傳標(biāo)記的Ac/Ds轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)中，通過GFP熒光檢測區(qū)分?jǐn)y帶T-DNA選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因后代和無選擇標(biāo)記的后代。剔除GFP熒光陽性植株，然后對陰性植株進(jìn)行Ds和目的基因序列的PCR檢測，篩選無選擇標(biāo)記的Ds植株。必須指出的是：在上述單熒光蛋白標(biāo)記的Ac/Ds轉(zhuǎn)座因子載體的轉(zhuǎn)基因植株群體中，由于GFP基因可能被就近轉(zhuǎn)座的Ds因子插入失活，或因?yàn)橹参镛D(zhuǎn)化過程中T-DNA發(fā)生重組，一定比例的植株的GFP基因表達(dá)受到影響，因而一部分熒光檢測呈陰性的分離植株仍然攜帶轉(zhuǎn)化標(biāo)記或T-DNA序列。為了對上述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，本研究構(gòu)建了攜帶GFP綠色熒光蛋白和mCherry紅色熒光蛋白的雙熒光蛋白標(biāo)記的Ac/Ds轉(zhuǎn)座因子載體，顯著提高了選擇系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低了上述“偽”無選擇標(biāo)記目的基因植株的篩選頻率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種轉(zhuǎn)座因子載體及獲得其無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因后代的方法，即一種產(chǎn)生無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)座因子載體及其轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法。