[發明專利]一種快速檢測金針菇培養料中阿氏節桿菌的方法

在審

• 申請號: 202011462765.9
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112522428A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 肖揚;王青;邊銀丙
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了一種快速檢測培養料中引起金針菇幼蕾腐爛病的阿氏節桿菌（Arthrobacter arilaitensis）的方法，以目標細菌的Y家族DNA聚合酶基因（簡稱Yf，位點014548.1）作為特異性分子標記，設計出擴增引起金針菇幼蕾腐爛的阿氏節桿菌的特異性引物。通過PCR技術直接檢測培養料等樣品中的病原細菌，達到監測金針菇栽培工廠環境中潛在病原菌的目的，預防工廠金針菇大規模化生產過程中病原細菌引起病害爆發，為金針菇提供安全的生長環境，降低食品安全風險，減少因病害造成的經濟損失。

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測培養料中引起金針菇幼蕾腐爛的阿氏節桿菌(Arthrobacter arilaitensis)的方法。

背景技術

金針菇栽培方式由最早的簡單設施化栽培演變為目前的大規模工廠化栽培，包括拌料、裝瓶、滅菌、接種、養菌、搔菌、子實體培養和采摘等一系列機械化操作及自動控制生長環節，且其所需的溫度、光照、pH、濕度及氧氣等生長因子均達到最適范圍，使金針菇在人工模擬可控的環境中實現周年化生產。在我國，金針菇是工業程度較高的食用菌，工廠化生產占據了金針菇市場的大部分份額。

病原細菌的快速鑒定是食用菌細菌性病害防控中的重要環節，有助于在工廠栽培環境中監測病原細菌，預防病害爆發。隨著各領域技術的發展，用于細菌鑒定的生物、物理、化學及其交叉學科方法均取得了進展。其中，DNA分子標記是一種較為常用的方法，以細菌基因組核苷酸序列變異為基礎，可揭示不同個體間DNA水平遺傳多態性，常用于細菌分類鑒定、系統發育及進化等研究。相比于傳統的形態特征及生理生化鑒定方法，具有便捷、靈敏、精準及穩定的優點，可滿足食用菌病害病原細菌的快速檢測需求。

常用于分類鑒定的細菌核糖體亞基基因包括16S rRNA，23S rRNA以及它們的間隔區序列，可用于細菌鑒定的DNA分子多態性標記方法有限制性內切酶片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)、擴增rDNA限制性分析(ARDRA) 等，其他DNA分子標記方法還包括脈沖電場凝膠電泳(PFGE)、多重PCR、DNA探針及基因芯片等。以上分子標記方法多應用于細菌屬水平或群體分類進化研究，但存在過程繁瑣、操作復雜且重復性差的缺點，針對食用菌病原細菌的快速檢測，不具有明顯優勢。在已知病原細菌的前提下，基于PCR擴增技術，設計病原細菌的特異性分子標記，可在待測樣品中針對性地快速檢測病原細菌，達到監測食用菌病害的目的。據此，從金針菇病原細菌的基因組信息中篩選出目標基因，設計特異性擴增引物進行鑒定，是一種實現病原細菌快速檢測的可行方法。

發明內容

本發明提供了一種快速檢測培養料中引起金針菇幼蕾腐爛的阿氏節桿菌(Arthrobacter arilaitensis)的方法，選取Y家族DNA聚合酶基因(簡稱Yf，位點NC_014548.1)作為特異性分子標記，由此設計出阿氏節桿菌的特異性引物，根據擴增的特異片段檢測工廠環境中潛在的目標致病細菌，該方法可用于快速監測工廠栽培環境中的微生物安全問題，為金針菇工廠化發展增加保障。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

以目標細菌阿氏節桿菌(Arthrobacter arilaitensis)的Y家族DNA聚合酶基因(簡稱Yf，位點NC_014548.1)作為特異性分子標記，根據Yf基因設計引物 Yf-F(SEQ IDNO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2)。

一種快速檢測培養料中引起金針菇幼蕾腐爛的阿氏節桿菌(Arthrobacterarilaitensis)的方法，包括以下步驟：

(1)采集金針菇的培養料，提取培養料總DNA；

(2)以培養料總DNA為模板，引物Yf-F(SEQ ID NO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2)進行PCR擴增；