[發明專利]一種微生物絕對定量方法及其應用

有效

• 申請號: 202011461550.5
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112538520B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 吳群;徐巖;杜如冰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/06;C12R1/07;C12R1/225;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

1.一種微生物定量方法，其特征在于，所述方法包括：待測樣品中DNA發生解鏈；加入過量信號探針，與待測樣本的目標核苷酸片段結合形成雙鏈，使G四鏈體裸漏在序列之外；加入足量淬滅探針與未結合的信號探針形成雙鏈，破壞G四鏈體結構；利用裸漏在外G四鏈體與血紅素反應形成具有過氧化氫酶活性的G四鏈體/血紅素模擬酶，結合過氧化氫酶的活性表征微生物的生物量；其中，所述方法中不需要使用儀器使待測樣品中DNA發生擴增；

當定量細菌微生物時，信號探針序列為SEQ?ID?NO.1所示，對應的淬滅探針序列分別為SEQ?ID?NO.2所示；當定量芽孢桿菌屬微生物時，信號探針序列為SEQ?ID?NO.5所示，對應的淬滅探針序列分別為SEQ?ID?NO.6所示；當定量乳桿菌屬微生物時，信號探針序列為SEQ?IDNO.9所示，對應的淬滅探針序列分別為SEQ?ID?NO.10所示；當定量釀酒酵母時，信號探針序列為SEQ?ID?NO.13所示，對應的淬滅探針序列分別為SEQ?ID?NO.14所示；當定量真菌微生物時，信號探針序列為SEQ?ID?NO.17所示，對應的淬滅探針序列分別為SEQ?ID?NO.18所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣品為含有菌體、基因組或宏基因組的樣品。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣品是收集該樣品中的菌體后不經基因組提取，直接進行DNA解鏈處理。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法為絕對定量方法，還包括：建立過氧化氫酶活性和微生物的生物量的標準曲線，或者與過氧化氫酶活性呈相關性的指標和微生物的生物量的標準曲線；檢測待測樣品時，將檢測到的過氧化氫酶活性或者指標代入標準曲線，即獲得待測樣品中的微生物的生物量。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品為發酵食品或者取自發酵食品發酵過程中的樣品，或者腸道、土壤、水體等環境樣本。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵食品為以下任意一種以上：白酒、黃酒、醬油、啤酒、葡萄酒、食醋、發酵茶、傳統發酵蔬菜、發酵飲料、酸奶、干酪、果醋、酒釀、豆豉、乳腐。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵食品為酒精飲品、發酵米面食品。

8.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述微生物為以下任意一種或者多種類型：釀酒酵母、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬。

9.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述微生物為以下任意一種或者多種類型：細菌、真菌。

10.一種用于多種微生物絕對定量的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒能夠用于實現待測樣本中如下至少兩種類型的微生物的檢測：所有的細菌微生物、所有的真菌、所有的釀酒酵母、所有的芽孢桿菌屬、所有的乳桿菌屬；所述檢測試劑盒中，至少含有如下2套能檢測不同種屬的探針，每套探針中包括信號探針和淬滅探針；

（1）細菌探針：信號探針序列為SEQ?ID?NO.1，對應的淬滅探針序列為SEQ?ID?NO.2所示；

（2）芽孢桿菌探針：信號探針序列為SEQ?ID?NO.5，對應的淬滅探針序列為SEQ?ID?NO.6所示；

（3）乳桿菌屬探針：信號探針序列為SEQ?ID?NO.9，對應的淬滅探針序列為SEQ?IDNO.10所示；

（4）釀酒酵母探針：信號探針序列為SEQ?ID?NO.13，對應的淬滅探針序列為SEQ?IDNO.14；

（5）真菌探針：信號探針序列為SEQ?ID?NO.17，對應的淬滅探針序列為SEQ?ID?NO.18。