[發明專利]一株高絲氨酸生產菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011461387.2
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112592875B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 張娟;馮志彬;張洪霞;徐明志;楊進;耿子歸
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 袁瑞紅

本發明公開了一株高絲氨酸生產菌及其構建方法和應用，本發明通過阻斷代謝途徑中中間產物的分支途徑，有效控制了代謝途徑的流向；同時引入外源基因，在生產菌中引入新的途徑，增加前體物草酰乙酸和天冬氨酸的含量；而且通過啟動子替換使一些關鍵基因的表達水平提高，獲得了高產L?高絲氨酸的基因工程菌，豐富了L?高絲氨酸的基因工程菌的來源，并且通過實驗發現天冬氨酸的產量高52.3g/L，糖酸轉化率達44.6％，和現有技術相比，產量和糖酸轉化率得到明顯的提高，具有一定的優勢，更具有大規模生產的應用潛力。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一株高絲氨酸生產菌及其構建方法和應用。

背景技術

L-高絲氨酸又稱2-氨基-4羥基丁酸，具有豐富的生物活性和保濕能力，是一種重要的化工中間體，廣泛應用于各種活性物質的合成。目前國內外主要采用化學法、生物酶催化法和微生物發酵法生產L-高絲氨酸。化學法的主流方法采用L-蛋氨酸和碘甲烷為反應起始物，其反應過程復雜繁瑣，而且碘甲烷毒性大，用量多，價格昂貴。生物酶催化法需要以丙酮酸和甲醛為底物，反應也存在成本高，毒性大，對環境不友好的缺點。微生物發酵法具有成本低，條件溫和，環境友好的優勢，是未來L-高絲氨酸工業化生產的趨勢。

L-高絲氨酸是L-天冬氨酸家族氨基酸合成途徑的一個重要中間產物，由于大腸桿菌染色體改造的分子生物學技術已經成熟，利用該方法有望獲得高產L-高絲氨酸的、無需添加抗生素的穩定生產菌。公開號為CN 108504613 A的中國發明專利公開了一種高絲氨酸生產菌株及其構建方法和應用，該方法通過找到了一些不利于高絲氨酸合成的基因將其敲除，找到了一些有利于其合成的基因增強其表達，并且突變與代謝途徑相關的幾個基因，發明人在進一步的研究中發現，不利于或利于高絲氨酸合成的基因，不限于上述專利中所指出的基因，發明人還發現了其它基因，通過敲除、增強或代謝其基因得到新的高絲氨酸生產菌株。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一株高絲氨酸生產菌ZFgs012(Escherichia coli)。

本發明提供的高絲氨酸生產菌ZFgs012，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期為2020年11月11日，保藏編號為CGMCC NO.21153，保藏地址為中國北京。

本發明的目的之二在于提供上述高絲氨酸生產菌的構建方法，具體包括：

A.敲除大腸桿菌W3110中不利于高絲氨酸合成的基因，獲得基因敲除菌株；所述基因選自ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA、thrB中的一個或多個；

B.增強步驟A中所述基因敲除菌株中有利于高絲氨酸合成的基因的表達，獲得基因增強菌株；所述基因選自PEPC、AspA、metL的中的一個或多個；

C.在步驟B中所述的基因增強菌株中引入有利于高絲氨酸合成的外源基因，獲得高絲氨酸生產菌ZFgs012，所述外源基因選自PC和/或AspDH。

優選地，步驟B中獲得基因增強菌株采取啟動子替換，替換的啟動子來源于pGEX-4T1的Tac啟動子，并突變lacI操縱子序列。

優選地，上述高絲氨酸生產菌的構建方法，具體包括如下步驟：

A.敲除大腸桿菌W3110中的基因ldhA、pflB、adhE、pta、gdh、dapA、metA和thrB，獲得基因敲除菌株；

B.增強在步驟A中所述基因敲除菌株中的基因PEPC、AspA和metL，使這些基因表達量增加，獲得基因增強菌株；

C.在步驟B中所述的基因增強菌株中引入外源基因PC和AspDH，獲得的高絲氨酸的生產菌。

本發明的目的之三在于提供上述高絲氨酸生產菌在高效生產高絲氨酸中的應用。