[發(fā)明專利]一種水稻功能基因檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011458632.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN112575060A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯靜;趙建華;羅輝;李亞君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢市景肽生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6895
• 代理公司: 湖北天領(lǐng)艾匹律師事務(wù)所 42252
• 代理人: 楊建軍

1.一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、抽提液準(zhǔn)備：拿出60ml帶蓋的離心管，向離心管中加入22～34ml的抽提液，然后將其放入到裝有70～80ml離子水的燒杯中，接著對(duì)燒杯進(jìn)行加熱處理，使燒杯中離子水的溫度保持在55～68℃范圍內(nèi)，使離子水對(duì)抽提液進(jìn)行預(yù)熱處理，預(yù)熱時(shí)間為5～8min；

S2、水稻葉研磨：取水稻幼期的水稻葉4～5片，每片葉的重量控制在4～8g，然后將葉片給剪碎，剪碎完畢后，將其放入到研缽內(nèi)，并且向研缽內(nèi)加入60～80ml的液氮，然后對(duì)剪碎后的葉片進(jìn)行研磨處理，將其研磨成細(xì)粉狀；

S3、混入抽提液：將步驟S2中研磨成粉狀的葉片放入到預(yù)熱完畢的抽提液中，用玻璃棒對(duì)其進(jìn)行攪拌處理，將其攪拌均勻，攪拌完畢后，將其放入到55～64℃的水浴中，進(jìn)行水浴保溫處理；

S4、DNA提取：向水浴完畢后的溶液中加入18～22ml的氯仿、濃度為3～6％的戊醇、濃度為12～24％的乙醇，接著將其混勻，并且在搖床設(shè)備上振蕩15～22min，振蕩完畢后，將溶液放入到離心機(jī)中進(jìn)行離心工作，離心完畢后，將上層清液倒入到干凈的離心管中，加入14～24ml的異丙醇，將其混勻，然后靜置5～8min，出現(xiàn)纖維狀沉淀，將纖維狀沉淀取出，在吸水紙上吸干，接著將其放入到TE溶液中溶解，溶解完畢后，加入3～6ul的RNase溶液中混勻，混勻完畢后，再加入3～5mol/l的NaOAc溶液混合，混合后在-18～22℃的溫度下靜置26～34min，即可得到DNA纖維沉淀物；

S5、凝膠制備：稱取1.2～1.8g瓊脂糖，向瓊脂糖中加入120～160ml的TAE溶液，然后對(duì)其進(jìn)行加熱處理，直至瓊脂糖完全融化，融化完畢后，使其室溫冷卻至52～63℃后，加入EB溶液，然后用攪拌棒攪拌，攪拌完畢后，將其緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子；

S6、電泳：取出步驟S4中0.4～0.6g的DNA纖維沉淀，然后取出步驟S5中1.6～2.4ul的凝膠溶液，將其和DNA纖維沉淀物混合，混合后，用移液器將其加入電泳設(shè)備上的電泳槽中，之后接通電源，電泳指示染料采用溴酚藍(lán)，電泳完畢后，采用紫外凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，觀察溴酚藍(lán)的變色情況，然后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行記錄。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S1中，抽提液是由88～105mmol/L的Tris-HCL溶液、16～24mmol/L的EDTA溶液、440～540mmol/L的NaCl溶液以及1.2～1.8％的SDS溶液混合而成，其中Tris-HCL溶液的PH值為7.8～8.2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3中，玻璃棒的攪拌時(shí)間為5～7min，攪拌速度為3～5r/s。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3中，水浴保溫時(shí)間為25～36min，保溫過程中，每隔5min對(duì)研缽內(nèi)的溶液攪拌一次，保證其受熱均勻。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S4中，溶液離心時(shí)間為14～26min，離心速度為2400～2600r/min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S4中，TE溶液的PH值為7.9～8.4，溶解時(shí)，使其每毫升含有12～45ug的DNA濃度。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S5中，EB溶液的容量為8～14ul，攪拌棒的攪拌時(shí)間控制在4～6min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻功能基因檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S6中，對(duì)樣品電泳時(shí)，電壓為1～6V/cm。