[發明專利]一種定量檢測耶氏肺孢子菌的引物組及試劑盒和應用

有效

• 申請號: 202011456429.3
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112458196B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 鄭柏松;張文艷;劉新;桓晨;李兆龍;王虹;高文英
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京專贏專利代理有限公司 11797
• 代理人: 劉梅

本發明適用于生物技術領域，提供了一種定量檢測耶氏肺孢子菌的引物組及試劑盒和應用，該引物組包括正向擴增引物和反向擴增引物；所述正向擴增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；所述反向擴增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。該引物組可以用于熒光定量PCR檢測耶氏肺孢子菌，其設計嚴謹，操作簡單快速，靈敏性高，特異性強，結果判定準確客觀。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種定量檢測耶氏肺孢子菌的引物組及試劑盒和應用。

背景技術

肺孢子肺炎病原體一直被認為是原蟲，但在1988年證實是一種介于子囊真菌亞門與擔子真菌亞門之間的真核生物，為真菌家族的一員。1999年將寄生于人體導致人類肺孢子菌肺炎(PCP)的病原命名為耶氏肺孢子菌。臨床診斷PCP病例依靠臨床表現，確診需要發現的滋養體和或包囊。然而，由于不能體外培養，一般采取染色方法進行診斷，但該方法陽性率低，操作繁瑣費時，制約了的病原學診斷，容易造成誤診和漏診。

近年來，國外多項研究認為，聚合酶鏈式反應(PCR)方法可以明顯提高診斷的敏感性與特異性，并且在疾病早期就能發現是否感染該類真菌，可成為診斷的金標準之一。然而，由于該菌介于真菌和原蟲之間，形態類似原蟲，采用聚合酶鏈式反應需要提取該菌的核酸，要破壞該類真菌。技術上有一定的難道，國內有關該菌的檢測方法很少報道。專利申請號為描述了用加凝膠電泳法來檢測肺孢子菌，但是該方法操作繁瑣，開放式的操作還容易造成污染，不適合在臨床上應用。

由耶氏肺孢子菌引起的人肺孢子菌肺炎(PCP)多見于免疫功能低下或缺陷人群，死亡率極高。隨著腫瘤化療患者、接受免疫抑制劑治療的器官移植者、自身免疫性疾病患者等高危人群的擴大，特別是1984年發現首例艾滋病以來，其發病率呈急劇增加的趨勢。PCP是艾滋病患者最主要的并發癥和致死原因，被視為艾滋病的“標志病”。

PCP的早期診斷比較困難，其原因在于患者的臨床癥狀、體征、X線胸片及常規實驗室檢查均無特異性；患者少痰，即使采用誘痰法，病原體檢出率亦較低；血清抗體檢測因健康人群抗肺孢子菌抗體陽性率較高而無臨床意義；肺組織活檢因創傷較大而難以實行等。

目前現有診斷技術主要有：

1、病原學診斷查獲包囊為確診依據。收集痰液或支氣管分泌物涂片染色后鏡檢，雖取材方便但檢出率很低。皮穿刺肺活檢、支氣管鏡肺活檢開胸肺活檢，雖檢出率高，但損傷大，因而不常用。此外，該方法對檢驗人員的業務能力要求較高，人為因素影響大。常用染色方法有姬姆薩、甲苯胺藍和四胺銀染色法等。

2、免疫學診斷。由于大多數正常人都曾有過肺孢子菌隱性感染，血清中都有特異性抗體存在，故檢測血清抗體的方法一般不用于肺孢子菌病的診斷。

3、X線檢查。卡氏肺孢子菌肺炎典型病例的線表現為兩肺先出現混合性肺泡及間質性改變，以網狀結節狀浸潤為主，從肺門向外周擴展，當病情進展時，可見肺野斑片狀實變影，其間常伴有廣泛性或局灶性肺氣腫和小段肺不張，以肺的外圍最為明顯。有的斑片狀實變影很快融合成大片狀均勻致密的浸潤影響，病變廣泛而呈向心性分布，與肺水腫相似，這一X線表現具有診斷特異性。但該方法不適于疾病的早期診斷，在臨床診療中意義不大。

由于健康人群中體內肺孢子菌的陽性率較高，因此，定性的核酸檢測缺少意義，而定量檢測方法對判斷免疫低下患者罹患PCP的風險具有提示作用，對PCP患者的早期診斷具有重要作用。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種定量檢測耶氏肺孢子菌的引物組，旨在解決背景技術中提出的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種定量檢測耶氏肺孢子菌的引物組，其包括正向擴增引物和反向擴增引物；所述正向擴增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示；所述反向擴增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。