[發明專利]黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法

在審

• 申請號: 202011453356.2
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112626250A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 黃飛燕;葉賢文;余磊;劉佳妮;陳澤斌;柯艷果;魏環宇;方宇;王啟宇;趙婭紅;薛至勤
• 申請（專利權）人: 昆明學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 牛林濤

1.黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

(1)稱取煙草莖部樣品50mg至液氮中研磨；

(2)加600uL溶解液繼續研磨，直至溶解；

(3)轉移勻漿至小管，離心力14000Xg，室溫條件下離心處理2min；

(4)取上清液，加一倍水相70％乙醇，渦旋混勻；

(5)取600uL含乙醇的水相到柱子上，離心力14000Xg，室溫條件下離心處理1min；

(6)去下游液體，加400uL洗液到柱子上，離心力14000Xg，室溫條件下離心1min，去下游液體，重復此步驟兩次，完成第一次清洗；

(7)配制DNase I混合液：取1uL DNase I稀釋至5uL，取1uL稀釋液，加入5uL DNase I緩沖，44uL無菌水，用槍頭吹打混勻；

(8)步驟(6)第一次清洗之后，在柱子上加入步驟(7)配制好的DNase I混合液，離心力14000Xg，室溫條件下離心1min,轉移下游液體到柱子上，室溫放置15min；加400uL洗液到含DNaseⅠ的柱子上，放置1min,離心力14000Xg，室溫條件下離心1min,棄下游液體，重復一次，完成第二次清洗；

(9)離心力14000Xg，室溫條件下空離2min；

(10)將柱子轉移到提供的1.5mL收集管，加50uL RNA洗脫液到柱子上，離心力200Xg離心2min，室溫；離心力14000Xg離心1min，室溫；將柱子轉個方向，室溫，離心力14000Xg離心1min；

(11)檢測RNA質量，樣本儲存于-80℃，長期保存；將提取的RNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，取1uL樣品使用無酶水按一定比例稀釋后，70℃變性2min，運用安捷倫生物分析儀檢測RNA的純度和完整性。

2.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：所述煙草莖部樣品采用以下步驟處理獲得：

(1)將煙草種子依次進行75％乙醇45s、5％次氯酸鈉8min浸泡和無菌水沖洗處理；

(2)播種于育苗棚漂浮盤中，育苗基質采用高溫高濕滅菌處理；

(3)待煙草長至8～10片真葉期時，轉入晝夜溫度分別為30℃和25℃、光暗時間比為12/8，濕度≥70％的人工氣候箱中，適應性培養7d；

(4)采用人工莖基部注射接種黑脛病生理小種孢子懸浮液，每株接種5ml，取莖基部以上1cm組織樣品1g，對所取樣品進行無菌水清洗，然后滅菌紙檫干，迅速用液氮冷凍樣品并將其放入-80℃超低溫冰箱保存，完成煙草莖部樣品的制備。

3.根據權利要求2所述的黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：所述黑脛病生理小種孢子懸浮液采用以下步驟制備：

(1)將分離純化的煙草黑脛病生理小種在燕麥培養基上培養21d，得到菌絲；

(2)用0.1％KNO₃和1％葡萄糖混合液浸泡所述菌絲，并放入26℃恒溫箱培養72h，再將其置于8℃冰箱中處理20min取出，室溫下10～30min有大量游動孢子釋放，過濾，鏡檢，調整游動孢子的濃度為1×10³～1×10⁴個/ml。

4.根據權利要求3所述的黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：所述的燕麥培養基的組份按重量百分數計，包括：燕麥片30g，瓊脂粉15g，去離子水1000ml。

5.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：所述的檢測方法使用聯川生物公司提供的TRK1001試劑盒提取抗病材料和感病材料的組織樣品RNA。

6.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草microRNA檢測方法，其特征在于：所述步驟(5)水相較多時，重復操作步驟(5)。