[發明專利]非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重熒光PCR檢測試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 202011453158.6
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112481416A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 于新友;王金良;孟衛芹;沈志強;陳金龍;董林;王海麗
• 申請（專利權）人: 山東綠都生物科技有限公司;山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 牟京霞

1.非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，包含核酸釋放劑、反應預混液Premix Taq、熒光染料LyGreen、陰性對照、陽性對照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.如權利要求1所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為用于非洲豬瘟病毒擴增的引物組，SEQ ID NO.1為上游引物，基因序列為CCAAAGGGCTCCTCCACT；SEQ ID NO.2為下游引物，基因序列為ATGGCATCTATCAGGTTCACTC。

3.如權利要求1所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4為用于豬傳染性胸膜放線桿菌擴增的引物組，SEQ ID NO.3為上游引物，基因序列為CCGTAGGATTGCGGGTAA；SEQ ID NO.4為下游引物，基因序列為ATCCGAACCACTAACAGACA。

4.如權利要求1～3任一項所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物的濃度均為10pmol/μL，引物混合液中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4的摩爾比為1:1:1:1。

5.如權利要求4所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，核酸釋放劑通過以下方法制備得到：

以純化水、濃HCl、Tris堿配制500mM/L的Tris-HCl溶液，加入NaCl，使NaCl濃度達到150mM/L，加入乙二胺四乙酸二鈉，使乙二胺四乙酸二鈉濃度達到3mM/L，加入2％(質量體積比)的十二烷基磺酸鈉、加入0.5％(質量體積比)的十二烷基硫酸鋰和1％(質量體積比)的甜菜堿，混勻，即可。

6.如權利要求1～3任一項所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，陽性對照為含有SEQ ID NO.5所示基因序列的pMD-MGF質粒和SEQ ID NO.6所示基因序列的pMD-apxⅣ質粒組成的混合質粒，陰性對照為無核酸酶水。

7.如權利要求6所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，pMD-MGF質粒與pMD-apxⅣ質粒的體積比為1:1。

8.如權利要求6所述的非洲豬瘟病毒和豬傳染性胸膜放線桿菌雙重LyGreen熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，SEQ ID NO.5所示基因序列為非洲豬瘟病毒MGF基因序列，如下：

CCTTTTTGATAGAGGGAACACCGAAGCTACGTTGCTAACGCAACATCTCAAGAAGACAGCGGCCAAAGGGCTCCTCCACTTTGTGCTAGAAACGTTAAAATACGGCGGCAACATAGATACCGTCCTGACCCAAGCCGTAAAGTACAATCATAGAAAACTTTTAGATTATTTTCTGCGTCAACTACCTCGTAAACATATTGAAAAACTTTTGTTGCTGGCCGTGCAGGAAAAGGGCTTCTAAAAAAACATTGAACTTACTGTTGTCACATTTAAACTACTCCGTGAAACGCATCAAAAAACTACCGCGCTATGTGATAGAGTACGAGTCCACCTTGGTGATAAAGATTTTATTAAAAAAAAGAGTGAACCTGATAGATGCCATGTTGGAAAAGATGGT。