[發(fā)明專利]一種基于多步等溫循環(huán)擴(kuò)增的17β-雌二醇超靈敏檢測方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011453030.X
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112359095B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白家磊;吳瑾;劉明珠;趙尊全;高志賢;彭媛;寧保安;王偉亞
• 申請（專利權(quán)）人: 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6844;G01N33/53
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

1.一種基于多步等溫循環(huán)擴(kuò)增的17β-雌二醇檢測方法，該方法包括以下步驟：

S1. 構(gòu)建復(fù)合DNA修飾的磁珠

將3'端生物素標(biāo)記的適配體和cDNA混合，得到復(fù)合DNA，將鏈霉親和素修飾的磁珠與所述復(fù)合DNA混合，得到復(fù)合DNA修飾的磁珠；

所述適配體為17β-雌二醇適配體，所述cDNA為17β-雌二醇適配體的互補(bǔ)序列；

S2. 合成環(huán)DNA

將用于滾環(huán)擴(kuò)增的鎖式探針和引物探針混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接，然后加入核酸外切酶去除未環(huán)化的鎖式探針和引物探針，得到環(huán)DNA；

S3. 多步等溫循環(huán)擴(kuò)增

將含有17β-雌二醇的待測溶液與復(fù)合DNA修飾的磁珠混合反應(yīng)，反應(yīng)后將溶液進(jìn)行磁分離，取溶液的上清液，加入模板DNA、鏈置換擴(kuò)增用限制性核酸內(nèi)切酶、具有鏈置換活性的DNA聚合酶和dNTPs混合孵育反應(yīng)后，加入環(huán)DNA、滾環(huán)擴(kuò)增用酶、dNTPs、分子信標(biāo)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增和分子信標(biāo)的識別；然后采用熒光分光光度計測熒光值；

其中，所述模板DNA能夠與cDNA特異性識別并經(jīng)鏈置換擴(kuò)增生成ssDNA；所述ssDNA能夠與環(huán)DNA特異性識別，啟動RCA-多引物RCA反應(yīng)，生成L-ssDNA；所述分子信標(biāo)能夠與L-ssDNA特異性識別，并通過結(jié)合L-ssDNA恢復(fù)其熒光；

所述含有17β-雌二醇的待測溶液由待測樣品制備，所述待測樣品為自來水、污水、牛奶、酸奶或奶酪；

所述適配體的序列為5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCT CTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-Biotin-3'（SEQ ID NO：1）；

所述cDNA的序列為5'-AAAATTTAAAATGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQ ID NO：2）；

所述鎖式探針的序列為5'-Phosphate-ATTGAATTACACCTCAGCCCCTACCA TTATTAATAGACTGCCTCAGCCACCATCACCTTTGCTATTTAACCTCAGCGCTTCCAGCTT-3'（SEQ ID NO：3）；

所述引物探針的序列為5'-TGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQ ID NO：4）；

所述模板DNA的序列為5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACCTCAGCTTCCAGCTT ATTGAATTACA-3'（SEQ ID NO：5）；

所述ssDNA的序列為5'-CTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAG-3'（SEQ ID NO：6）；

所述L-ssDNA為多重復(fù)單元序列，其中一個重復(fù)單元序列為5'-GCTGAGGTTAAATAGCAAAGGTGATGGTGGCTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAGGTGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQID NO：7）；

所述分子信標(biāo)的序列為5'-FAM-ATGACTACACCATCACCTTTGCTATTTAATAGT CAT-BHQ1-3'（SEQ ID NO：8），兩端分別修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán);

所述方法用于非疾病診斷目的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多步等溫循環(huán)擴(kuò)增的17β-雌二醇檢測方法，其中，步驟S1中，3'端生物素標(biāo)記的適配體和cDNA的摩爾比為1:1-4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多步等溫循環(huán)擴(kuò)增的17β-雌二醇檢測方法，其中，該方法還包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟：按照步驟S1-S3，檢測一系列已知濃度的17β-雌二醇，測得多個熒光值，分別以濃度和熒光值作為橫縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于多步等溫循環(huán)擴(kuò)增的17β-雌二醇檢測方法，其中，該方法還包括：基于標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算含有17β-雌二醇的待測溶液中17β-雌二醇的濃度。