[發(fā)明專利]一種SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011452772.0
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112458136A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張部昌;劉蘭蘭;汪焰勝;吳杭;員江嵐;張萬祥;徐穎;韓阿龍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽大學(xué)
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12N1/15;C12N15/31;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 合肥中博知信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34142
• 代理人: 管秋香

本發(fā)明公開了一種SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌及其應(yīng)用，SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌的構(gòu)建方法包括以下步驟：S1，以1409?P1、1409?P2、1409?P3和1409?P4為引物，糖多孢紅霉菌基因組為模板，擴增SACE_1409基因的上、下游各約1.5kb的同源片段；S2，將擴增后的SACE_1409上下游片段分別連接到pUCTSR載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pUCTSRΔ1409，以此質(zhì)粒為模板，通過擴增獲得用于基因敲除的大片段tsr?Δ1409；S3，將tsr?Δ1409大片段轉(zhuǎn)化到糖多孢紅霉菌原生質(zhì)體中，同源重組后，篩選SACE_1409基因被tsr替換的基因工程菌株，即SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過基因工程途徑缺失糖多孢紅霉菌染色體上SACE_1409基因，能夠大幅度提高紅霉素產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖多孢紅霉菌技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于糖多孢紅霉菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

放線菌是目前大多數(shù)抗菌類藥物的重要來源，其產(chǎn)生的次級代謝物及其衍生物在臨床應(yīng)用廣泛。糖多孢紅霉菌所產(chǎn)生的次級代謝物紅霉素，是一種具有廣譜抗菌作用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌及梭形芽孢桿菌等病原菌,有強大抗菌作用。

紅霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用化學(xué)方法低成本合成的難度較大；傳統(tǒng)誘變獲取高產(chǎn)菌株的策略，面臨篩選復(fù)雜和傳代穩(wěn)定性的問題。因此，利用基因工程方法是提高紅霉素產(chǎn)量的一個重要途徑。調(diào)控因子在微生物的生長、代謝、外界信號感知與傳遞等方面具有重要作用，可調(diào)控次級代謝產(chǎn)物如抗生素的生物合成。通過對調(diào)控因子的遺傳操作可有效提高抗生素產(chǎn)量。本發(fā)明目的就是通過基因工程途徑定向改變基因來獲得紅霉素高產(chǎn)菌株。

目前國內(nèi)外多個課題組深入研究了糖多孢紅霉菌初級及次級代謝的調(diào)控基因。Chng等于2008年報道了糖多孢紅霉菌中與紅霉素合成相關(guān)的第一個正調(diào)控因子BldD(SACE_2077)。本實驗室近幾年來集中開展糖多孢紅霉菌TetR家族調(diào)控因子(TetR Familytranscriptional Regulator,TFR)研究，建立了在糖多孢紅霉菌中染色體快速失活技術(shù)，鑒定出SACE_0012、SACE_7040等TFR參與糖多孢紅霉菌形態(tài)分化，SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、PccD(SACE_3396)、SACE_Lrp(SACE_5388)、SACE_5754等TFR參與紅霉素生物合成的調(diào)控。其中SACE_3986、SACE_7301對紅霉素生物合成分別具有負(fù)向調(diào)控和正向調(diào)控的作用，對它們的改造均可提高紅霉素產(chǎn)量，申請的專利已獲授權(quán)(專利號分別為ZL201410014348.6、ZL201310082765.X)。研究過程中發(fā)現(xiàn)TetR家族調(diào)控因子SACE_1409是SACE_3986與SACE_7301調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要靶點，通過對SACE_1409進(jìn)行研究，以進(jìn)一步提高紅霉素的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供了一種SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌及其應(yīng)用，提高紅霉素生產(chǎn)的產(chǎn)量。

SACE_1409可以結(jié)合紅霉素生物合成基因簇內(nèi)所有基因的啟動子區(qū)，直接負(fù)向調(diào)控紅霉素生物合成，影響紅霉素的產(chǎn)量。

為解決上述問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

一種SACE_1409基因被改造的糖多孢紅霉菌，改造方法為通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌中TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因SACE_1409缺失，利用抑菌試驗、HPLC(HighPerformance Liquid Chromatography)檢測、qRT-PCR(Real-time Quantitative PCR)以及EMSA((Electrophoretic Mobility Shift Assay)實驗，證明了缺失SACE_1409基因可以提高紅霉素產(chǎn)量，且SACE_1409直接負(fù)向調(diào)控紅霉素生物的合成。