[發明專利]香蔥內參基因及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 202011448711.7
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112458099B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 郭元元;陳振東;張力;陳琴;蔣月喜;李洋;宋煥忠;車江旅;秦龍妹
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12Q1/6809;C12Q1/6895
• 代理公司: 廣西中知科創知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 牙斐穎

本發明提供一種香蔥內參基因及其篩選方法和應用，屬于分子生物學領域。選取13個候選內參基因Ac18S、Af18s、Af28s、AcActin、AfActin、AfTUA、AfTUB、AsSAND、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a、AfCYC，利用實時熒光定量RT?qPCR技術對其在高溫脅迫處理中的表達水平進行檢測，結合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評價13個內參基因的穩定性，最后進行綜合分析，得到高溫脅迫下最適合的香蔥內參基因為AfActin，為后續香蔥基因表達相關的科學研究提供了參考。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及香蔥內參基因及其篩選方法和應用。

背景技術

香蔥，又稱：蔥、細香蔥、北蔥、火蔥。拉丁文名：Allium fistulosumL.var.caespitosum Makino.百合科、蔥屬植物，鱗莖聚生，矩圓狀卵形、狹卵形或卵狀圓柱形；鱗莖外皮紅褐色、紫紅色至黃白色，膜質或薄革質，不破裂。葉為中空的圓筒狀，向頂端漸尖，深綠色，常略帶白粉。植株小，葉極細，質地柔嫩，味清香，微辣，主要用于調味和去腥。原產于亞洲西部，在我國南方較為廣泛的栽培，歐洲和亞洲的一些地方也有栽培。香蔥既是日常必不可少的重要辛香調料，更是重要的參與精準扶貧、南菜北運、出口脫水蔬菜品種。

香蔥性喜冷涼。在南方地區香蔥周年生產情況下，高溫是香蔥夏秋生產中面臨的最大產業瓶頸。高溫環境下極易造成蔥管退綠、蔥尖干黃、蔥白腐爛、組織老化和纖維增多、病害頻發甚至絕收等現象，嚴重影響香蔥的產量、品質和效益。針對產業需求開展香蔥耐熱分子機理機制研究有非常重要的理論和應用價值。

基因功能的行使是從DNA到mRNA再到蛋白的一個過程，基因表達水平一般是通過基因轉錄mRNA的量來衡量。因此，準確評估目標基因的表達量對研究其生物學功能意義重大。內參基因即內源性參照基因，理想上內參基因應在所有組織、細胞中均有表達，在不同環境、條件下均能穩定表達且不受任何內外因素影響。而在實際研究過程中，常用內參基因的表達在不同組織器官中、不同處理條件下、不同類型細胞中和不同發育階段中并不絕對恒定，因此，在利用熒光定量PCR進行目的基因表達的研究時，第一步應根據不同的試驗條件、試驗樣品篩選合適穩定的內參基因。常見的內參基因有β-actin、EF-1α、18S rRNA、28SrRNA等。目前為止，尚未見高溫脅迫下香蔥專用內參基因相關研究的報道。這嚴重制約了香蔥分子育種研究進程。因此，在香蔥中挖掘高度可信的內參基因十分必要。

發明內容

本發明的發明目的是，針對上述問題，提供一種香蔥內參基因，為后續香蔥基因表達相關的科學研究提供了參考。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種香蔥內參基因，所述內參基因為AfActin，所述內參基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

還提供了一種用于擴增權利要求1所述內參基因的PCR引物，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

還提供了一種香蔥內參基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、選擇10個香蔥基因和3個其他品種內參基因作為內參候選基因，其中，10個香蔥基因為：Af18s、Af28s、AfActin、AfTUA、AfTUB、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a和AfCYC；3個其他品種內參基因為：洋蔥Ac18s、洋蔥AcActin、大蒜AsSAND；并設計熒光定量PCR引物。

S2、提取高溫脅迫處理下的“桂香蔥1號”以及“AF35”的總RNA，反轉錄成cDNA，作為熒光定量PCR的模板，以步驟S1中設計的引物為熒光定量PCR引物，進行熒光定量PCR實驗，獲得熒光定量PCR數據。