[發明專利]一種芝麻離體再生培養方法以及百里香酚作為所用培養基添加劑的應用

有效

• 申請號: 202011446612.5
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112514794B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 徐如強;張雪;劉金蕊;李道朋;崔旭杰
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H6/66
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

本發明公開了一種芝麻離體再生培養方法，并首次公開了百里香酚作為植物組織培養基添加劑在促進和提高芝麻外植體的愈傷組織誘導及分化率與再生幼苗生根方面的應用。本發明利用含有百里香酚的培養基配方，以芝麻幼苗的子葉作為外植體，建立了一種快速、高效的芝麻離體再生技術體系，解決了目前芝麻組織培養中的外植體容易褐化、培養周期長、重復性差、基因型依賴性強和植株再生頻率低等一些突出問題，為芝麻的快速繁殖、種質保存與創新以及轉基因技術應用提供了一種簡便可靠的技術方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種芝麻離體再生培養方法，本發明還涉及百里香酚作為所用培養基中添加劑的應用。

背景技術

在植物組織培養領域，芝麻是目前公認的屬于組織培養困難的幾種作物之一，迄今仍面臨外植體容易褐化、組織培養周期長、重復性差、基因型依賴性強和植株再生頻率低等一系列突出問題，不易獲得完整的離體再生植株。因此，芝麻組織培養尚未有效地應用于芝麻的遺傳改良，并且以此技術為基礎的芝麻轉基因研究也受到巨大限制。

目前，國內外雖有少數關于芝麻愈傷組織誘導及分化與植株再生獲得成功的公開報道，但人們卻很難對這些技術方法進行重復驗證，而且植株再生頻率也很低，一般僅為0.1%到10%左右。也有報道記載了利用從芝麻種子中剝取的子葉作為外植體進行離體培養，比較容易獲得叢生芽的方法，但是該文作者卻沒有在后續的實踐中成功加以應用。鑒于對該技術進行深入研究和應用的需要，當前迫切需要建立一套可靠而行之有效的芝麻離體再生的技術，以便滿足芝麻遺傳改良和生產發展的需求。

百里香酚(5-methyl-2-Isopropylphenol；或者Thymol)，又名麝香草酚，是一種天然存在于植物中的單萜酚類物質，具有廣泛的殺菌、抗氧化、消炎、抗腫瘤和殺蟲等活性，常用于制作香料、防腐劑、藥物和指示劑等，但在植物組織培養領域中的應用卻未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種芝麻離體再生培養方法，為芝麻的遺傳改良和進一步研究提供了新的技術思路。本發明還提供了百里香酚在植物組織培養基中的應用。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的一種芝麻離體再生培養方法，其中在愈傷組織的誘導及分化與再生幼苗的生根培養階段所用的培養基中均添加有百里香酚，其具體培養方法包括下述步驟：

第一步，無菌苗培養

按1L的 1/2MS（Murashige Skoog）培養基中加入30g蔗糖,8g瓊脂粉的比例配制生長培養基備用；

選取籽粒飽滿的芝麻種子用乙醇和水清洗干凈，再用配制的HgCl₂溶液處理，然后用無菌水清洗干凈后種植在生長培養基上置于培養室內培養6天，獲得無菌苗；

第二步，切取子葉外植體

將第一步獲得的無菌苗用手術刀切取子葉外植體，并保留2mm葉柄；

第三步，愈傷組織的誘導及分化

按1L的 MS減銨培養基（這里是指不含硝酸銨的MS基礎鹽培養基）中加入6-芐基腺嘌呤2mg，萘乙酸0.1mg，百里香酚50 mg，蔗糖30 g，瓊脂粉8g的比例，配制誘導及分化培養基備用；

將第二步切取的子葉外植體接種到誘導及分化培養基上，置于培養室內離體培養；培養過程中，首先可觀察到外植體明顯膨大，然后在子葉柄的傷口處出現愈傷組織，進而可看到分化產生的再生芽；當再生芽長到高度1cm左右時，切除未分化的外植體部分，僅保留帶有愈傷組織的再生幼苗繼續培養；在整個培養過程中，每兩周進行一次繼代培養；

第四步，再生幼苗的生根培養

按1L的MS培養基中加入吲哚丁酸0.5mg，百里香酚50mg，蔗糖30g，瓊脂粉8g的比例配制生根培養基備用；