[發明專利]使用多重熒光PCR技術檢測ZNF384相關融合基因的引物、探針及應用

在審

• 申請號: 202011445696.0
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112522403A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 董越;鄒媛;杜翠;張辰
• 申請（專利權）人: 濟南艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍

本發明涉及使用多重熒光PCR技術檢測ZNF384相關融合基因的引物、探針及在試劑盒中的應用。本發明將ALL疾病相關的ZNF384融合基因整合在一起進行篩查，能更全面地輔助ALL疾病的診斷、治療及預后監測，相較于以往的FISH等方法，該方法具有更高精度，且便于結果的判讀。而且本發明將引物及探針的合理配比以及優化，將檢測條件達到最佳，從而大大提升了效率。并且，多重熒光PCR技術敏感度高，特異性高，樣品需求少，成本較低，適于大批量臨床樣本的篩查。

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，涉及使用多重熒光PCR技術檢測ZNF384相關融合基因的引物、探針及在試劑盒中的應用。本發明篩查的ZNF384相關融合基因包括：EP300-ZNF384、ARID1B-ZNF384、CREBBP-ZNF384、TCF3-ZNF384、TAF15-ZNF384、BMP2K-ZNF384，共計6種。

背景技術

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最常見的兒童惡性腫瘤，也是造成兒童死亡的主要原因。遺傳學異常(基因融合、非整倍體等)是導致ALL發生的主要原因，而基于此的分子分型對臨床診斷、風險分級及靶向治療意義重大。尚有20％～30％的ALL遺傳學特征不明，隨著基因組學技術的發展，轉錄因子鋅指蛋白384(zinc-finger protein 384,ZNF384)融合陽性ALL以其獨特的臨床及生物學特征引起關注。

ZNF384易發生基因融合，大部分與兒童ALL有關，病例報道多見于亞洲國家，在亞洲人群的發生率約占ALL總數的4％。目前已經發現的融合伴侶有9種：ARID1B、BMP2K、E1A結合蛋白P300(E1A binding protein P300，EP300)、EP300旁系同源CREB結合蛋白(CREBbinding protein，CREBBP)、SMARCA2、SYNRG、TATA盒結合蛋白相關因子15(TATA-boxbinding protein associated factor 15，TAF15)、EWS RNA結合蛋白1(EWS RNA bindingprotein 1，EWSR 1)、轉錄因子3(tranion factor 3，TCF3)。ZNF384融合伴侶不同，但都具有相似的轉錄特征譜而緊密的聚為一類，區別于其他已知的ALL亞型，結合全外顯子測序分析更進一步發現該ALL亞型伴有明顯的表觀調控基因改變。研究發現ZNF384融合陽性ALL患兒白血病細胞具有祖B細胞特征性免疫表型——CD10表達弱陽性或陰性且具有一種或多種髓樣抗原(CD13、CD33)異常表達，提示B細胞分化阻滯在這個階段，根據生存分析數據提示，該亞型患兒預后較EVT6-RUNX1+亞型差。

因ZNF384基因和一些融合伴侶的染色體區域(TCF3、EWSR1、EP300、ARID1B)位于靠近其各自染色體臂的末端端粒位置，大大增加常規G帶核型分析難度；FISH試劑成本高，靈敏度不及PCR；PCR配合電泳的方法流程耗時久，過程易污染，結果難判斷，且反應體系較多成本也相應的增高，不適用于臨床的大批量篩查。

發明內容

鑒于目前篩查檢測ZNF384相關融合基因的方法學的可選擇性較小，而綜合考慮成本、特異性及臨床普及問題，本發明設計出了一套用于多重熒光PCR技術檢測ZNF384相關常見融合基因的引物、探針，并構思出一種靈敏度高、特異性好、適用于大通量篩查的檢測方法。

一種用熒光PCR技術篩查及鑒定EP300-ZNF384、ARID1B-ZNF384、CREBBP-ZNF384、TCF3-ZNF384、TAF15-ZNF384、BMP2K-ZNF384這6種相對常見ZNF384相關融合基因的引物及探針，采用多重熒光PCR技術，將存在于ZNF384基因的三組下游引物、及其對應的探針配對不同的上游基因上的多條上游引物。其核苷酸序列如下：

篩查上述融合基因的引物探針還包括擴增作為內參的管家基因ABL的引物和探針，其核苷酸序列如下：