[發明專利]一種培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法及引物和表達盒

在審

• 申請號: 202011444103.9
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112522300A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 黃勝;倪哲;廖舟翔;金霞
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;C12N15/113;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

1.一種培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，該方法包含：

通過編輯OsSULTR3；6基因啟動子區，使位于OsSULTR3；6基因轉錄起始位點上游的第422位至第403位的靶標序列產生突變，以獲得廣譜抗細菌性條斑病水稻；其中，所述靶標序列為如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述突變為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中第4位的G堿基缺失。

2.根據權利要求1所述的培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，通過CRISPR/Cas9系統編輯OsSULTR3；6基因啟動子區，所述CRISPR/Cas9系統的重組載體pYLCRISPR/Cas9-TT2是通過將TT2-sgRNA和pYLCRISPR/Cas9-MT通過酶切連接重組后轉化至大腸桿菌獲得的；

其中，所述TT2-sgRNA是以pOsU6a-TT2-gRNA質粒為模板，進行兩輪PCR反應獲得的，所述TT2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；其中，所述pOsU6a-TT2-gRNA質粒是通過將pU6a-gRNA載體和TT2-gRNA退火產物連接獲得的，該TT2-gRNA退火產物為根據所述靶標序列設計的引物的退火產物，根據所述靶標序列設計的引物TT2-gRNA-F、TT2-gRNA-R的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求2所述的培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，所述兩輪PCR反應中，第一輪中有兩個PCR反應，一個PCR反應的引物為：核苷酸序列分別如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.3所示的引物U-F、TT2-gRNA-R，另一個PCR反應的引物為：核苷酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.5所示的引物TT2-gRNA-F、sgRNA-R；第二輪反應以第一輪中兩個PCR反應的產物為模板，PCR反應的引物為：核苷酸序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示的引物B1-F、BL-R。

4.根據權利要求2所述的培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，所述pU6a-gRNA載體與TT2-gRNA退火產物連接之前需經酶切，采用的酶為BsaI酶。

5.根據權利要求2所述的培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系統的重組菌株EHA105/pYLCRISPR/Cas9-TT2是通過將所述重組載體pYLCRISPR/Cas9-TT2轉入農桿菌EHA105中獲得的。

6.根據權利要求5所述的培育廣譜抗細菌性條斑病水稻的方法，其特征在于，該方法還包含：

將所述重組菌株EHA105/pYLCRISPR/Cas9-TT2侵染水稻的成熟胚誘導的愈傷組織，在含潮霉素抗生素培養基上培養的植株為轉基因陽性植株；

以所述轉基因陽性植株的總DNA為模板，用核苷酸序列分別如SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9所示的引物pTT2-F、pTT2-R擴增，并對擴增產物片段進行測序，通過分析測序峰圖判斷靶位點的編輯情況，選出靶位點有突變的水稻株系；

提取靶位點有突變的植株葉片總DNA為模板，用核苷酸序列分別如SEQ ID No.10、SEQID No.11所示的引物hyg-F、hyg-R擴增，將擴增產物凝膠電泳，篩選不含潮霉素標簽且靶位點被編輯的純合子廣譜抗病水稻株系，為廣譜抗細菌性條斑病水稻。

7.廣譜抗細菌性條斑病水稻的OsSULTR3；6基因啟動子區中的序列，其特征在于，OsSULTR3；6基因啟動子區中如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中第4位的G堿基缺失。

8.用于擴增權利要求6中所述轉基因陽性植株的總DNA的引物，其特征在于，該引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。