[發明專利]一種功能化DNA水凝膠、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 202011442361.3
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112661987B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 甘明哲;吳丹;崔金輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: C08J3/24
• 分類號: C08J3/24;C08J3/075;C08L71/02;C08K5/18;C12N15/63
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 王茹;王鋒

本發明公開了一種功能化DNA水凝膠、其制備方法及應用。所述制備方法包括：使包含含馬來酰亞胺基的高分子化合物、含巰基的高分子化合物、多巴胺及巰基修飾的DNA的均勻混合體系于室溫進行交聯反應，獲得功能化DNA水凝膠。本發明提供的功能化DNA水凝膠的制備過程簡單、快速且成本低廉，不需要引發、促凝等條件，制備時成膠速度快，一般在60秒以內，且可實施性高，可用于無細胞蛋白表達中；同時，本發明的功能化DNA水凝膠的機械強度較高，不易破碎，既可以對巰基修飾的PCR產物進行保護，又可以增加模板的局部有效濃度，進一步提高蛋白表達量；并且該水凝膠可以進行重復使用，降低了蛋白表達成本。

技術領域

本發明涉及一種新型水凝膠，具體涉及一種用于無細胞蛋白表達(cell-freeprotein?synthesis,CFPS)的功能化DNA水凝膠及其制備方法與應用，屬于水凝膠技術領域。

背景技術

目前，蛋白類藥物比如抗體、多肽等在疾病治療中越來越廣泛，但是，目前所面臨的問題是，抗體類藥物比如治療癌癥的靶向藥，因為其價格昂貴，很多患者往往因為承受不了價格而放棄治療。抗體類藥物之所以價格貴主要是因為成本高。目前蛋白質類藥物生產的主要方式是活細胞內產生然后提取，操作步驟多，需要進行細胞培養，培養過程中也容易造成污染，從而提高了蛋白質藥物生產的成本。無細胞蛋白合成(cell-free?proteinsynthesis,CFPS)系統的出現為解決上述問題提供了可能的解決途徑。無細胞蛋白合成是一種不依賴于完整細胞結構的體外生命模擬系統，它是利用細胞提取物物中的蛋白質因子、酶和蛋白合成機器，以外源DNA或mRNA為模板，補充氨基酸和能量等，實現目標蛋白的體外表達，為蛋白質和肽的體外合成提供了一個強大的平臺，為高效表達蛋白質提供了一種非生物途徑。CFPS突破了細胞的生理限制，具有獨特的優勢:它能直接利用線性DNA模板，如PCR產物，如將含有目的基因的質粒通過PCR轉化成線性模板，直接利用CFPS體系進行蛋白表達，縮短了蛋白合成時間。但是，由于線性模板易受無細胞表達體系中核酸酶的降解，導致模板濃度降低，從而降低蛋白表達效率。

現階段，業界研究者們主要從兩個方向著手來保護線性模板，來提高CFPS中蛋白表達效率。一個方向是抑制或降低核酸酶的活性；第二個方向是保護線性DNA減少與核酸酶的接觸減少模板降解提高模板的局部濃度。

Ahn等人采用了敲除編碼核酸內切酶E基因的菌株制備無細胞抽提物，延遲了mRNA分子被降解，來自PCR擴增得到的模板表達的蛋白質水平變得與常規基于質粒的反應相當。但是存在的問題是該菌株生長緩慢，周期較長。

來自噬菌體λ的Gams蛋白被鑒定為RecBCD核酸酶的有效抑制劑，該蛋白的截斷形式GamS已被用于無細胞蛋白表達，抑制核酸酶活性，蛋白表達量可以達到接近質粒水平，但是存在的問題是需要在細菌體內合成并純化這種蛋白，操作繁瑣。

Luo課題組報道了一種DNA黏土雜交水凝膠，該凝膠通過DNA和粘土之間的靜電相互作用來模擬細胞的封閉功能，粘土水凝膠可以提供有效的封閉環境，保護基因不受核酸酶的侵害。當他們進一步將這種混合水凝膠用于CFPS系統時，蛋白質的產量是液相系統的6倍。但是這種粘土水凝膠的機械強度比較低，表達完難以回收，給重復利用帶來困難。

綜上，現有技術中直接對菌株進行基因改造導致了菌株生長緩慢，周期較長；采用合成RecBCD核酸酶抑制劑的方式需要蛋白的合成和純化，操作繁瑣；運用粘土水凝膠，機械強度低，難以重復利用。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種功能化DNA水凝膠及其制備方法，以克服現有技術中的不足。

本發明的另一個目的在于提供所述功能化DNA水凝膠在細胞蛋白表達中的應用。

為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案：

本發明實施例提供了一種功能化DNA水凝膠，它是由含馬來酰亞胺基的高分子化合物、含巰基的高分子化合物、多巴胺及巰基修飾的DNA經交聯反應制得的。