[發明專利]LdCsm-dCsm3突變型復合物、含該復合物的檢測系統及其在RNA檢測中的應用

有效

• 申請號: 202011435126.3
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112760308B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 佘群新;于振霄;馮旭;馮明霞;王媛
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12N15/70;C12Q1/6818
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 孫維傲

1.LdCsm-dCsm3突變型復合物在制備RNA檢測試劑盒中的應用，其特征在于，所述LdCsm-dCsm3突變型復合物在常溫下28天內保持60~70%的活性；

所述LdCsm-dCsm3突變型復合物，由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五種蛋白亞基以及crRNA組裝而成，其中Csm3亞基的第34位氨基酸由天冬氨酸突變為丙氨酸；

Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5與crRNA的化學計量關系為Csm1₁2₃3₄4₁5₁:crRNA₁；

Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5與crRNA的空間關系為Csm3和Csm2亞基沿crRNA形成雙螺旋狀的骨架，Csm1亞基與Csm4亞基結合在crRNA的5’端，Csm5亞基結合在crRNA的3’端；

crRNA的長度為34~38個堿基，5’端前8個堿基序列為5’-ACGAGAAC-3’；

所述復合物的分子量為317kDa；

所述LdCsm-dCsm3突變型復合物通過三種質粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3^D34A和pET30a-Csm2在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表達合成；其中，pUCE-X質粒中，X表示目標RNA；

pUCE-X質粒的構建方法包括：（1）根據目標RNA選定Spacer；（2）Spacer與Lactobacillus delbrueckiisubsp. Bulgaricus CRISPR array的Repeat序列組成Repeat-Spacer單元，根據Repeat-Spacer單元設計重疊延伸引物；（3）引物通過重疊延伸獲得有多個重復的Repeat-Spacer單元，將片段插入pUCE質粒獲得表達crRNA的質粒pUCE-X。

2.LdCsm-dCsm3突變型復合物在制備RNA檢測藥物或在制備表達目標RNA的病原體檢測藥物中的應用，其特征在于，所述LdCsm-dCsm3突變型復合物在常溫下28天內保持60~70%的活性；

所述LdCsm-dCsm3突變型復合物為權利要求1中所述的LdCsm-dCsm3突變型復合物。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述RNA包括天然RNA、DNA體外轉錄產生的RNA、以及DNA經過體外擴增后再經過體外轉錄產生的RNA。