[發明專利]一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202011429030.6
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112557670A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 王彬;劉必成;曹婧媛
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N23/04
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 饒富春

1.一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法，其特征在于，檢測IMN的方法包括以下步驟：

S1：從健康對照、IMN患者和非IMN患者的晨尿中分別獲得尿液外泌體；

尿液外泌體通過晨尿經多次離心后獲得；

S2：尿液外泌體的鑒定

鑒定所制備的尿液外泌體是否符合外泌體的形態、粒徑特征；

S3：制備相同上樣量的尿液外泌體蛋白樣品

S4：采用免疫印跡法檢測尿液外泌體的PLA2R蛋白

S5：結果判定：以正常對照免疫印跡灰度值的最高值為截斷值，超過截斷值的指示為IMN。

2.根據權利要求1所述的一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法,其特征在于，所述S1中獲得尿液外泌體具體包括以下步驟：將受試者晨尿第一次經2000g離心20min去除脫落細胞及碎片，所獲上清第二次經13500g離心30min去除微粒，所獲上清經200000g超速離心2h，得到的半透明沉淀物即為尿液外泌體。

3.根據權利要求2所述的一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法,其特征在于，所述S2中尿液外泌體的形態采用透射電鏡觀察，具體包括以下步驟：

S21：吸取5ul尿液外泌體與5ul 4％的戊二醛混合固定20min；

S22：滴加到200目的載樣銅網上，室溫靜置10min，用濾紙洗掉多余液體；

S23：用2％磷鎢酸5ul染色5min，用濾紙洗掉多余液體；

S24：干燥后于透射電鏡下成像拍照。

4.根據權利要求2所述的一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法,其特征在于，所述S2中尿液外泌體的粒徑分布采用納米顆粒跟蹤分析儀測定。

5.根據權利要求3所述的一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法,其特征在于，所述S3中制備相同上樣量的尿液外泌體蛋白樣品具體包括以下步驟：用蛋白裂解液在冰上裂解外泌體30min，12000g離心30min，將所獲上層清液移至干凈1.5ml Ep管內，采用BCA法測定蛋白濃度；根據蛋白濃度，用裂解液稀釋，加入上樣緩沖液，配置成20μl體積、1μg/μl濃度的蛋白樣品，充分混勻，100℃煮沸5min，冷卻至室溫后，樣品制備成功。

6.根據權利要求5所述的一種基于尿液外泌體PLA2R檢測IMN的方法,其特征在于，所述S4中采用免疫印跡法檢測尿液外泌體PLA2R蛋白，具體步驟包括：進行SDS-PAGE電泳；將膠上的蛋白轉移至PVDF膜上；5％BSA封閉1h；然后予試劑盒中的抗體室溫孵育2h；TBS-T洗膜三次，每次10min；劑盒中的抗兔二抗室溫孵育1h；TBS-T洗膜三次，每次10min；采用ECL化學發光液顯影，以Tanon曝光機定時曝光30s所得條帶為灰度值測定條帶；采用image J測定目的條帶灰度值。

7.根據權利要求6所述檢測IMN的方法中的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的抗體為：針對尿液外泌體PLA2R的特異性抗體；試劑盒中的抗兔二抗為：針對PLA2R特異性抗體的二抗。

8.根據權利要求7所述試劑盒的應用，其特征在于，所述試劑盒的應用包括以下步驟：

S10：在第一時間點測定IMN患者的尿液外泌體中PLA2R的水平；

S20：在第二時間點測定所述IMN患者的尿液外泌體中PLA2R的水平，第二時間點晚于第一時間點；

S30：比較兩個時間點尿液外泌體PLA2R水平，與第一時間點相比，第二時間點尿液外泌體PLA2R水平下降表明治療有效，水平不變或增加表明治療無效。