[發明專利]用于檢測微衛星不穩定性狀態的方法及系統

有效

• 申請號: 202011421089.0
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112259165B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 孫大偉;辛琳;張騰龍;陳鵬燕;段小紅;師雅寧;王東亮
• 申請（專利權）人: 北京求臻醫療器械有限公司
• 主分類號: G16B25/20
• 分類號: G16B25/20;G16B30/00;C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 姚瓊斯

1.用于檢測微衛星不穩定性狀態的系統，其特征在于：包括用于對腫瘤樣本的微衛星不穩定狀態進行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型準備模塊，用于判別樣本微衛星不穩定性狀態的高靈敏度位點；數據質控模塊，用于對靶向捕獲數據進行質控，進行微衛星不穩定性檢測；MSI狀態檢測模塊，用于掃描樣本比對結果中所有有效位點，對該樣本的微衛星位點狀態進行預測，根據MSIscore來判別樣本的MSI狀態；

高靈敏度位點如下表所示：

2.使用權利要求1所述的用于檢測微衛星不穩定性狀態的系統來檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一、對腫瘤患者的癌變組織樣本進行DNA提取，之后進行DNA片段化處理，末端修復加poly-A尾，進行接頭連接；

步驟二、將接頭的DNA純化后，加入PCR反應混合液進行擴增，將擴增產物純化后，進行雜交、捕獲、PCR擴增、純化得到測序文庫；

步驟三、通過二代上機測序得到腫瘤組織樣本靶向捕獲測序數據，根據MSI模型進行微衛星不穩定狀態檢測相關的信息分析，不用于癌癥診斷和治療；

將測序文庫在高通量測序儀Illumina上完成測序得到測序數據，通過MSI模型對腫瘤樣本的微衛星不穩定狀態進行信息分析，所述MSI模型包括MSI模型準備模塊、數據質控模塊和MSI狀態檢測模塊；

所述MSI模型準備模塊的工作過程為：通過掃描人類參考基因組，獲取基因組序列上所有的微衛星位點的位置和側翼序列；對于上述獲取的微衛星位點，利用2000個全外顯子腫瘤-正常成對的測序樣本數據比對到參考基因組上，來獲取全基因組上所有微衛星位點列表；過濾位點并采用機器學習方法進行訓練，共得到121個高靈敏度微衛星位點，同時這121個微衛星位點能夠被測序的試劑盒覆蓋。

3.根據權利要求2所述的檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于所述步驟一中DNA末端修復加poly-A尾方法具體為：將體積比為(5-8):(10-20):100的“A”酶混合物、“A”緩沖液和片段化處理的DNA渦旋混勻后離心，放置在熱循環儀上，反應程序如下：20℃30min，65℃，30min，4℃，保持。

4.根據權利要求2所述的檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于所述步驟一中接頭連接具體為：將體積比為(3-5):(25-30):(3-8):100的UMI標簽的接頭、連接緩沖液、連接酶和末端修復的DNA渦旋混勻后離心，放置于熱循環儀上，反應程序如下：20℃30min，4℃，保持。

5.根據權利要求2所述的檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于所述步驟二中文庫擴增具體為：將體積比為1：(2-5)：(4-7)的擴增引物、接頭的DNA和2X PCR混合液，渦旋混勻后離心，放置于熱循環儀上，反應程序如下：98℃45s，循環1次；98℃15s，60℃30s，72℃30s，循環8次；72℃30s，循環1次；4℃1min，循環1次。

6.根據權利要求2所述的檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于所述步驟二中純化具體為：將DNA樣本加入質量分數為80％wt的乙醇純化后的磁珠，充分混合均勻后，室溫靜置5min后，置于磁力架靜置2min，待磁珠全部吸附至側壁，移除清液后，緩慢加入質量分數為80％wt的乙醇，靜置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠狀態為表面不反光，然后用TE緩沖液重懸磁珠，充分混勻，室溫靜置1min，置于磁力架靜置2min，待磁珠完全吸附至側壁，將上清液移出待用。

7.根據權利要求2所述的檢測微衛星不穩定性狀態的方法，其特征在于所述步驟二中雜交具體為：將500ngDNA擴增產物中加入5μL快速封閉試劑和2μL P5、P7封閉試劑，使用濃縮儀將擴增產物濃縮到干粉狀態，然后加入體積比為(80-90)：(25-30)：(15-20)的雜交緩沖液、雜交增強劑和無核酶水，室溫靜置10min，充分震蕩混勻后放置在熱循環儀上，反應程序如下：95℃10min，65℃，保持。