[發(fā)明專利]一種ARMS-TaqMan Blocker體系的Blocker雙鏈設(shè)計方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011420550.0
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112522369A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊芳梅;徐紅梅
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥歐創(chuàng)基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6886
• 代理公司: 合肥律眾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34147
• 代理人: 趙娟

本發(fā)明公開了一種ARMS?TaqMan Blocker體系的Blocker雙鏈設(shè)計方法，將Blocker設(shè)計在互補鏈上，形成非競爭性Blocker，與競爭性Blocker同時使用；非競爭性Blocker設(shè)計原則：將Blocker設(shè)計在突變位點處，覆蓋突變位點；Blocker與野生型模板完全匹配；Blocker與突變型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值與退火溫度一致或接近；Blocker的3’末端添加多個與模板不匹配的無關(guān)堿基。本發(fā)明創(chuàng)造性提出非競爭性Blocker設(shè)計原則，與競爭性Blocker同時使用，形成雙鏈壓制體系，可針對初期產(chǎn)生的少量非特異產(chǎn)物進行壓制，在保證體系靈敏度不受影響的前提下，大大提高體系的特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤突變檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種ARMS-TaqMan Blocker體系的Bloc ker雙鏈設(shè)計方法。

背景技術(shù)

近年來，探針的非放射性標記受到廣泛重視，同時得到迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于核酸序列測定、基因檢測以及疾病診斷等。ARMS技術(shù)是常用的熒光探針法，其基本原理是，如果引物的3’端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據(jù)已知點突變設(shè)計3條引物，其3’端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。有時候為了提高特異性，會在體系中加入野生型模板擴增阻斷劑(Blocker)，用以壓制野生型模板的擴增，雖然這種方法在一定程度上可以壓制野生，但是由于缺乏準確的Blocker設(shè)計軟件和有效的篩選規(guī)則，導致壓制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3’端倒數(shù)第二或第三個堿基處引入錯配堿基，但是引入錯配堿基通常會犧牲靈敏度。因此，常規(guī)ARMS-TaqMan Blocker體系一般很難同時做到靈敏度、特異性兼顧，常需要復雜繁瑣的優(yōu)化工作。

傳統(tǒng)的競爭性Blocker設(shè)計在與ARMS引物部分交疊的位置，起到競爭性作用，但僅能對非特異模板的單鏈進行壓制，如果ARMS引物的特異性不理想，初期產(chǎn)生的少量非特異產(chǎn)物會成為后續(xù)擴增的模板，并且逃離Blocker的壓制作用，增加了非特異信號。

傳統(tǒng)的競爭性Blocker設(shè)計原則為：①將Blocker設(shè)計在突變位點處，覆蓋突變位點，與ARMS引物部分重疊，起到位置競爭作用，且盡量使突變位點位于Blocker的中間位置，使得Blocker熔點差較大(依據(jù)：突變位點位于中間時的熔點差大于突變位點位于兩邊時的熔點差)；②Blocker與野生型模板完全匹配，Tm值比ARMS引物與野生型模板匹配的Tm值高約5℃，使Blocker與野生型模板優(yōu)先結(jié)合，而且有時為了增大熔點差，會加入LNA、MGB等修飾；③Blocker與突變型模板不完全匹配，Tm值比ARMS引物與突變型模板匹配的Tm值低，使ARMS引物與突變型模板優(yōu)先結(jié)合；④Blocker的3’末端需加上封閉修飾，如硫代修飾、氨基修飾、磷酸化修飾等，以防止延伸。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有ARMS-TaqMan Blocker體系的Blocker設(shè)計存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種非競爭性Blocker設(shè)計，與競爭性Blocker設(shè)計同時使用，形成雙鏈壓制的ARMS-TaqMan Blocker體系。

本發(fā)明保護一種ARMS-TaqMan Blocker體系的雙鏈Blocker設(shè)計方法，將Blocker設(shè)計在互補鏈上，形成非競爭性Blocker，與競爭性Blocker同時使用。

非競爭性Blocker設(shè)計原則：將Blocker設(shè)計在突變位點處，覆蓋突變位點；Blocker與野生型模板完全匹配；Blocker與突變型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值與退火溫度一致或接近；Blocker的3’末端添加多個與模板不匹配的無關(guān)堿基。