[發明專利]利用維生素B2

有效

• 申請號: 202011417612.2
• 申請日: 2020-12-05
• 公開（公告）號: CN112481227B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 董聰;高慶華;羅同陽;王玥;王慶慶;馬金國;樊曉東;馬清河;秦艷梅
• 申請（專利權）人: 河北省微生物研究所有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N1/16;C12R1/84
• 代理公司: 石家莊海天知識產權代理有限公司 13101
• 代理人: 田文其

1.利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，是將保藏編號為CGMCCNO.14382的巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris接種至以甘油為碳源的發酵培養液中進行培養；其特征在于包括如下工藝步驟：

A、菌株培養階段

接種量為10％～15％，發酵培養基選用BSM培養基，每升發酵培養液中含有4～4.5mLPTM1，發酵培養液在反應釜中的裝量為45％～56％，在溫度為28℃～30℃、攪拌轉速為600～700轉/分鐘、pH＝4.8～5.2、通風量為1.2～2.0vvm的條件下通氣攪拌培養l8～24小時；

B、碳源飼喂階段

當發酵過程中甘油耗盡時流加包含10～14mL/LPTM1且質量體積比為50％的甘油，流加量為12～16mL/h/L，流加時間為4～6小時；

C、饑餓飼喂階段

至OD₆₀₀≈160～180，停止流加甘油至培養基中甘油耗盡；

D、誘導表達階段

流加包含10～14mL/LPTM1的甲醇使發酵液中甲醇終濃度維持在0.2％～0.3％左右，控制pH＝5.9～6.1，控制甲醇溶液的流加速度使發酵液中溶氧量≈0，在誘導過程加維生素B₂水溶液至培養液中維生素B₂終濃度為0.5mM～1mM，當酶活不再升高時停止發酵。

2.根據權利要求1所述的利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，其特征在于還包括擴大培養階段，是將保藏編號為CGMCC NO.14382的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris制成種子液。

3.根據權利要求2所述的利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，其特征在于所述的擴大培養是將保藏編號為CGMCC No.14382的巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris接種到5mLYPD液體培養基中，在溫度為28～30℃、震蕩速率為200～250轉/分鐘的條件下振蕩培養12～16小時制成一級種子。

4.根據權利要求3所述的利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，其特征在于按體積比為3％～5％接種量將一級種子轉接于80～120mLBMGY的搖瓶培養基中，在溫度為28℃～30℃、轉速為200～250轉/分鐘的條件下培養6～10小時，至OD₆₀₀≈6～8制成種子液。

5.根據權利要求1所述的利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，其特征在于所述的步驟A、D中調整pH采用濃氨水。

6.根據權利要求1所述的利用維生素B₂提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶產量的方法，其特征在于步驟D中每隔12小時取樣一次檢測OD₆₀₀和菌體濕重，每隔12小時測定表達的葡萄糖脫氫酶的活性。